FYF基因的克隆及轉(zhuǎn)化桂花和大巖桐.pdf

1、花的衰老是由外界環(huán)境因素和內(nèi)部衰老因子共同作用的結(jié)果，而乙烯是目前研究得最深入的內(nèi)部衰老因子之一，也是對花衰老作用最大的一種內(nèi)源激素?；ò甑乃ダ鲜怯梢蚁┑纳锖铣珊托盘栟D(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)雜調(diào)控的結(jié)果,在花發(fā)育和衰老過程中可以通過阻斷乙烯生物合成或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)某一環(huán)節(jié)來推遲花瓣衰老。目前有研究表明MADS-box基因AGL42也叫FOREVER YOUNG FLOWER(FYF)基因能夠有效抑制乙烯反應(yīng)下游基因的表達(dá)，使轉(zhuǎn)基因植株對乙烯不敏感，從而達(dá)到延

2、遲花衰老的目的。為了進(jìn)一步探討FYF基因在花衰老過程中的功能，本研究從擬南芥中克隆到FYF基因，構(gòu)建了其植物表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化幾個桂花品種和大巖桐。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴優(yōu)化了桂花的再生體系。不同濃度玉米素誘導(dǎo)大花金桂子葉切塊愈傷組織分化芽的影響結(jié)果表明：玉米素濃度為2.0mg·L-1培養(yǎng)基上分化出芽，0.5 mg·L-1的玉米素培養(yǎng)基上分化出根，隨著培養(yǎng)時間的加長發(fā)現(xiàn)玉米素濃度越高的培養(yǎng)基上愈傷組織褐化率越大，最適誘芽培養(yǎng)基

3、為1/2MS+2.0mg·L-1ZT+0.25 mg·L-1 TDZ；同時還研究了不同激素條件對幾個品種離體培養(yǎng)的桂花幼胚存活率、出芽率、幼苗平均株高以及平均叢生芽數(shù)等的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：籽銀桂幼胚在1/2 MS+0.5mg·L-1TDZ+0.1 mg·L-1NAA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，幼胚存活率為100％、萌芽率為50%、幼苗平均株高為3.9cm，叢生芽數(shù)達(dá)3個。蓮子丹桂幼胚存活率高達(dá)100%，其幼苗平均高度為2.2cm?！皬]州黃”籽銀桂平

4、均叢生芽數(shù)多達(dá)3個。⑵克隆了擬南芥FYF基因并構(gòu)建植物超表達(dá)載體。以擬南芥花芽cDNA為模板，擴(kuò)增得到FYF基因，利用BamH I和Pst I酶切位點(diǎn)，將FYF目的片段與質(zhì)粒 pCAMBIA13011連接，構(gòu)建植物超表達(dá)載體pCAMBIA13011-FYF，將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101。⑶用含有FYF基因的農(nóng)桿菌GV3101侵染幾個桂花品種的愈傷組織，經(jīng)過半個月的延遲篩選培養(yǎng)和半年的篩選培養(yǎng)最終得到Kan抗性愈傷組織，經(jīng)