家蠶HN1L蛋白在桿狀病毒侵染過程中調(diào)控機制的研究.pdf

1、家蠶是一種鱗翅目模式昆蟲，桿狀病毒是專一性侵染鱗翅目昆蟲的病毒，家蠶與桿狀病毒之間相互作用的研究具有多方面的應(yīng)用價值，二者之間相互作用機制的闡明對害蟲的生物控制、外源蛋白的真核表達以及宿主對病毒免疫抗性機制的揭示等方面都具有十分重要的意義。
　　血液-神經(jīng)表達蛋白1樣蛋白(hematalogical and neurological expressed1protein-like，hn1l)廣泛表達于多種動物組織中，該蛋白被抑制表達

2、后會出現(xiàn)細胞周期阻滯現(xiàn)象，是一種重要的功能蛋白，但其在家蠶細胞中的生物學(xué)功能尚未可知。前期的桿狀病毒感染前后的家蠶細胞蛋白質(zhì)表達差異組學(xué)分析結(jié)果顯示，家蠶HN1L蛋白在病毒侵染的家蠶細胞中表達水平顯著下調(diào)。為了深入了解該蛋白的生物學(xué)功能，主要研究了以下內(nèi)容:①通過對HN1L蛋白序列（基因序列號）進行生物學(xué)信息分析，發(fā)現(xiàn)家蠶HN1L與人類和小鼠同源性達到59％，并具有相同的保守結(jié)構(gòu)域。因此，推測家蠶HN1L蛋白可能也具有相似的生物學(xué)功能;

3、②構(gòu)建重組原核表達載體pET32a-hn1l并在大腸桿菌中進行表達、純化后，免疫新西蘭大白兔制備了多克隆抗體，用于后續(xù)研究;③構(gòu)建了重組瞬時表達載體pIEX-1-hn1l用于在家蠶細胞中過表達目的蛋白，Western blot檢測發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染BmN細胞36h后hn1l開始表達水平，48h后達到峰值，之后趨于穩(wěn)定，由此確定了最佳表達時間為48h;④細胞活力檢測發(fā)現(xiàn)HN1L蛋白過表達可以顯著增強細胞活力(p＜0.01)，促進細胞增殖;

4、⑤DNA片段化檢測結(jié)果表明，HN1L蛋白表達上調(diào)對DNA片段化水平有一定程度的抑制作用(p＜0.05)。此外，Western bolt檢測結(jié)果也顯示，與正常細胞相比，HN1L蛋白的過表達對于病毒感染誘導(dǎo)的caspase-9酶原活化和Bax表達水平上調(diào)均顯著下降，而Bcl-2的表達水平增加。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果也進一步證實，過表達HN1L可顯著抑制BmNPV感染誘導(dǎo)的細胞凋亡。因此，推測HN1L對細胞凋亡也具有一定的抑制作用;⑥檢測HN1L

5、蛋白過表達對細胞周期的影響，Western blot檢測結(jié)果顯示HN1L過表達的細胞中周期蛋白Cyclin D較正常細胞減少，同時流式細胞術(shù)檢測結(jié)果也表明G1期細胞減少而S期細胞增加(p＜0.05)，說明家蠶HN1L蛋白對細胞的G1/S期轉(zhuǎn)換有一定的促進作用;⑦通過熒光定量PCR技術(shù)檢測了病毒在過表達HN1L蛋白的BmN細胞中的復(fù)制能力，結(jié)果顯示病毒的復(fù)制能力顯著低于正常BmN細胞(p＜0.05)，說明HN1L蛋白對桿狀病毒的復(fù)制具有一