Spodoptera屬Su(var)3-9的鑒定及在桿狀病毒感染過程中的作用和持續(xù)增強型重組桿狀病毒的構建.pdf

1、第一部分 Spodoptera屬Su(var)3-9的鑒定及在桿狀病毒感染過程中的作用
　　核小體核心組蛋白N-端的各種翻譯后修飾，包括甲基化、乙?；⒘姿峄?、泛素化及糖基化等，會影響組蛋白、DNA及多種細胞因子之間的親和力而改變染色質的狀態(tài)和基因的表達。由于這些修飾作用往往會有類似于DNA遺傳密碼的功效，在生物體的發(fā)育和基因的選擇性表達與調控等多個方面起著至關重要的作用，故常被稱為“組蛋白密碼”。位點和狀態(tài)專一的組蛋白賴氨酸或精

2、氨酸甲基化修飾主要是由一類含有SET結構域的蛋白質——組蛋白甲基轉移酶(HMTs)催化完成的。在眾多的HMTs中，SUV39家族的Su(var)3-9特異性地負責催化組蛋白H3第九位賴氨酸(H3K9)的三甲基化，其催化反應產物H3K9mer3可以招募異染色質蛋白1(Heterochromatin protein1，HP1)，共同作用，導致異染色質化和基因沉默。同時，Su(var)3-9還能通過其N-端二聚化區(qū)與HP1的Chromo-Sh

3、adow結構域發(fā)生直接的相互作用。此外，通過HP1以及MeCP2(methyl-CpG-binding protein2)等蛋白的橋梁作用，Su(var)3-9還能間接地與其他表觀遺傳修飾因子如DNA甲基轉移酶(DNMT)和組蛋白去乙?；?HDAC)等發(fā)生關聯(lián)，進而參與到龐雜的表觀遺傳調控網絡之中。
　　病毒侵染宿主的過程經常會對宿主細胞的正?；顒赢a生多方面的影響，同時也會激發(fā)宿主細胞抵抗病毒侵染的自我防御。表觀遺傳因子時常會參

4、與到這些過程中。目前已經知道多種DNA病毒在侵入宿主細胞核后病毒基因組會形成類似于染色質的結構，進而受多種表觀遺傳修飾因子的調控。另一方面，病毒也會利用宿主細胞的表觀遺傳機制來保證自身的正常復制。桿狀病毒苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)在侵染草地貪夜蛾卵巢細胞系Sf9時，也會致使宿主細胞的多方面正常生物學行為發(fā)生紊亂，如造

5、成細胞骨架的改變，細胞周期停滯于G2/M期，全局性的mRNA水平的下調和蛋白表達的關閉等等。同時也有報道證實了AcMNPV感染宿主細胞后病毒基因組中存在類似于核小體的結構，并且多種表觀遺傳修飾因子抑制劑都會引起病毒基因復制和轉錄的改變。但是在AcMNPV與宿主的相互作用過程中是否受組蛋白甲基化狀態(tài)的影響，以及這種影響是通過何種方式進行的，至今尚無報道。
　　本研究在草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda），甜菜夜蛾

6、（Spodoptera exigua）及斜紋夜蛾（Spodoptera litura）三種Spodoptera屬的昆蟲中克隆和鑒定了組蛋白H3K9的三甲基轉移酶基因Su(var)3-9及其轉錄剪接變體eIF2γ基因。在對Spodoptera Su(var)3-9的生物信息學分析中發(fā)現其編碼的氨基酸序列在進化中高度保守，并且具有種屬特異性。在體外分別表達了Su(var)3-9及eIF2γ蛋白并制備了多克隆抗血清，對其在天然情況下細胞中的表

7、達情況進行了檢測確認，應用免疫熒光實驗證明Spodoptera Su(var)3-9定位于細胞核。GST pull-down實驗證實了Spodoptera Su(var)3-9與底物H3的結合，同時也分別與本研究中鑒定出的兩個亞型的異染色質蛋白1(HP1a、HP1b)結合。體外酶活實驗表明SpodopteraSu(var)3-9具有催化H3K9三甲基化的活性并受Su(var)3-9特異性抑制劑Chaetocin的抑制，且該催化活性具有劑

8、量依賴性，在27℃下的酶活性要明顯高于37℃。體內酶活分析同樣證實了Spodoptera Su(var)3-9催化組蛋白甲基化的能力以及后續(xù)產生的對細胞染色質緊實度和基因轉錄的影響。
　　進一步的研究發(fā)現在AcMNPV感染的Sf9細胞中，雖然絕大多數宿主細胞基因表達明顯下降，Su(var)3-9轉錄水平卻呈上升趨勢，伴隨宿主染色質變得更為緊實。添加抑制劑Chaetocin或過表達Su(var)3-9會分別激活或抑制AcMNPV基因

9、組的復制和病毒極早期到極晚期的多個基因的轉錄。
　　綜上所述，本研究首次發(fā)現組蛋白甲基轉移酶Su(var)3-9在桿狀病毒AcMNPV感染Sf9細胞時宿主基因表達的關閉過程中具有一定的作用，并且可能參與了細胞對入侵病毒的抵抗反應。這些結果為深入了解病毒與細胞的相互作用機制，和更好地開發(fā)利用桿狀病毒-昆蟲細胞系統(tǒng)提供了新的視野和思路。
　　第二部分牛乳頭瘤病毒1型復制元件顯著增強重組桿狀病毒介導的外源基因在哺乳動物細胞中的表達

10、
　　桿狀病毒AcMNPV作為一種新型的哺乳動物細胞蛋白表達和基因治療載體在近年來受到了研究者的越來越多的關注。與現有的其他病毒載體相比，它的優(yōu)勢主要在于:AcMNPV在哺乳動物細胞中不會復制，自身基因也不會表達，無細胞毒性;簡單的操作即可獲得高滴度的重組病毒;外源基因的容量大等等。然而，桿狀病毒介導的外源基因在哺乳動物細胞中的表達為瞬時表達，且表達水平往往不夠高，使得桿狀病毒載體在哺乳動物細胞中的應用受到一定的限制。尋求增強持續(xù)

11、表達的策略是目前亟待解決的問題。
　　牛乳頭瘤病毒1型（Bovine papillomavirus type1，BPV-1）是一種小型的DNA病毒，BPV-1基因組以多拷貝游離于染色體外的方式(episome)持續(xù)存在于被感染宿主的細胞中。病毒的上游調控序列（upstream regulatory region，URR）和早期蛋白E1，E2對病毒基因組復制的發(fā)動和維持是必需的，其他復制相關因子則全部由宿主提供。此外，在有E2蛋白存

12、在的情況下，URR還具有增強子的活性，可以對提高鄰近的異源啟動子的轉錄活性。
　　在本研究中，我們將BPV-1的這些元件引入桿狀病毒基因組中，并在多個哺乳動物細胞系中比較了重組桿狀病毒及對照組病毒介導報告基因的表達水平，同時還檢測了重組桿狀病毒的轉導對哺乳動物細胞產生的細胞毒性效應。研究發(fā)現，與對照病毒相比，在HEK293、HeLa、BHK-21、CNE、CHO-K1及MDCK細胞中，攜帶BPV-1 URR和E1，E2元件的重組桿

13、狀病毒介導的報告基因EGFP(enhanced green fluorescence protein)的表達水平均有了非常顯著的提高，表達時間也有所延長。此外，帶有BPV-1復制元件的新型的重組桿狀病毒載體對哺乳動物細胞沒有明顯的細胞毒性。
　　因此，BPV-1復制元件URR和E1，E2的存在能夠明顯改善桿狀病毒介導的外源基因在哺乳動物細胞中的表達，并且不影響桿狀病毒載體固有的生物安全性。這一結果有助于推進桿狀病毒作為一種更為有效