家蠶桿狀病毒表達的豬流行性腹瀉病毒S1蛋白及其黏膜免疫原性研究.pdf

1、豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcineepidemic diarrhea virus，PEDV)的感染引起的，導(dǎo)致仔豬發(fā)病率和致死率都極高的一種豬常見的病，研制新的安全有效的疫苗十分必要。鑒于纖突蛋白S是PEDV主要的中和表位和受體結(jié)合域，與病毒抗原性和吸附入侵密切相關(guān)，我們將PEDV S1(1～735 aa)區(qū)插入到GP64信號肽與特定膜錨定結(jié)構(gòu)(TMD)之間，并

2、與eGFP基因融合，構(gòu)建到轉(zhuǎn)移載體pFastBacHTB上，利用Bac-to-Bac系統(tǒng)構(gòu)建重組家蠶桿狀病毒rvBmBacmid-SP-S1-eGFP-TMD。重組病毒感染BmN細(xì)胞后，Western Blot檢測到約為150 kDa及400kDa的兩條帶，初步推斷是由于S1蛋白發(fā)生了N-糖基化以及形成了三聚體。
　　本研究以該重組病毒為免疫原霧化免疫BALB/c小鼠，野生病毒W(wǎng)T-BmNPV為陰性對照，TGEV/PEDV二聯(lián)滅活

3、疫苗為陽性對照。間接ELISA檢測霧化免疫16d后小鼠血清中PEDV特異性的抗體水平。ELISA結(jié)果表明，在重組病毒rvBmBacmid-SP-S1-eGFP-TMD和TGEV/PEDV二聯(lián)滅活苗霧化免疫16d的小鼠血清中均檢測到較高水平的PEDV特異性的抗體，且效價均可達1∶6400，說明重組病毒rvBmBacmid-SP-S1-eGFP-TMD和TGEV/PEDV二聯(lián)滅活苗霧化免疫能很好的刺激小鼠體液免疫反應(yīng)。針對分泌型免疫球蛋白A

4、(sIgA)的酶聯(lián)免疫分析結(jié)果顯示，不管是血清還是肺泡灌洗液，rvBmBacmid-SP-S1-eGFP-TMD免疫組產(chǎn)生的sIgA濃度均顯著高于TGEV/PEDV二聯(lián)滅活苗免疫組，說明rvBmBacmid-SP-S1-eGFP-TMD免疫小鼠后能刺激小鼠產(chǎn)生高水平的sIgA，引起了較強的黏膜免疫反應(yīng)。脾淋巴細(xì)胞增殖實驗表明與WT組相比，rvB mBacmid-SP-S1-eGFP-TMD組和TGEV/PEDV二聯(lián)滅活苗組均發(fā)生明顯增殖

5、(P＜0.05)，說明rvBmBacmid-SP-S1-eGFP-TMD和TGEV/PEDV二聯(lián)滅活苗免疫組小鼠淋巴細(xì)胞對抗原的重新接觸表現(xiàn)出了增殖效應(yīng)，對小鼠淋巴細(xì)胞的活化具有明顯的刺激作用，使小鼠產(chǎn)生了細(xì)胞免疫反應(yīng)。免疫鼠脾CD8+T淋巴細(xì)胞的流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示rvBmBacmid-SP-S1-eGFP-TMD組和TGEV/PEDV二聯(lián)滅活苗組CD8+T細(xì)胞比例均高于WT組，說明rvBmBacmid-SP-S1-eGFP-TMD