人對氧磷酶1在家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)中的表達及活性分析.pdf

1、對氧磷酶1（paraoxonase1，PON1）是生物體內(nèi)存在的一種廣譜的非專一性酯酶。它能通過催化磷酸酯鍵的水解，來降解有機磷酸、芳香羥基酸酯和氨基甲酸酯，從而對水解有機磷殺蟲劑及降解神經(jīng)毒劑發(fā)揮重要作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，PON1具有抑制低密度脂蛋白氧化的作用，與動脈粥樣硬化，慢性肝損傷、冠心病及Ⅱ型糖尿病等多種疾病的發(fā)病有密切關(guān)系。
　　在本研究中，我們首先利用實驗室構(gòu)建的含有pon1基因的重組表達質(zhì)粒pET-28a-pon1

2、，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達目的蛋白PON1。經(jīng)過Ni-NTA親和層析純化后，獲得純化的目的蛋白，用于PON1蛋白兔多克隆抗體的制備，為后續(xù)的真核表達產(chǎn)物檢測與純化奠定基礎(chǔ)。
　　家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)為真核表達系統(tǒng)，具有高效、安全性高、表達產(chǎn)物翻譯后修飾水平高、生產(chǎn)成本低等優(yōu)勢，是外源蛋白研究的理想表達系統(tǒng)。本研究利用該系統(tǒng)表達了pon1。首先，利用構(gòu)建了重組轉(zhuǎn)移載體pFastBac1-pon1，經(jīng)定點轉(zhuǎn)座重組構(gòu)建了重組桿狀病毒vBm-p

3、on1。對重組病毒進行滴度測定，然后以病毒感染的家蠶BmN細胞上清接種家蠶五齡幼蟲，待出現(xiàn)明顯發(fā)病癥狀后收集蠶血淋巴，用于后續(xù)的目的蛋白純化和活性測定。利用親和層析柱從蠶血淋巴中純化得到PON1，并與原核表達純化的PON1進行生物學(xué)活性比對，結(jié)果表明家蠶中表達的PON1酶活性明顯高于原核表達產(chǎn)物。為了研究糖基化修改對PON1酶活性的影響，我們利用N型糖苷酶PNGaseF對純化的PON1進行酶切去糖基化分析，酶切后的PON1在Wester