核糖體失活蛋白（RIPs）基因的克隆及其對(duì)甜菜遺傳轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、甜菜是世界上重要的糖料作物，但生產(chǎn)中甜菜病害較多，其產(chǎn)量和品質(zhì)受到嚴(yán)重威脅。改變植物性狀表現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因是最直接有效的手段。近年來(lái)，人們開(kāi)始嘗試通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化有目的地將抗病基因?qū)胩鸩似贩N，從中選育抗病、豐產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的甜菜新品種。雖然國(guó)內(nèi)外這方面的研究較多，但所取得的成效卻甚微，其主要原因是甜菜再生較為困難，遺傳轉(zhuǎn)化體系基因依賴(lài)性強(qiáng)。植物遺傳轉(zhuǎn)化方法有很多，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法由于其可以轉(zhuǎn)入的片段長(zhǎng)，拷貝數(shù)少，遺傳穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，一直是科學(xué)研究者重點(diǎn)研

2、究的方法。前人的研究結(jié)果表明，核糖體失活蛋白(RIPs)具有抗病毒、真菌、細(xì)菌等多種抗性。本研究是通過(guò)PCR法，將玉米(Zea mays)RIPs基因克隆出來(lái)，構(gòu)建重組質(zhì)粒，利用農(nóng)桿菌法將目的基因?qū)胩鸩?，并在已建立的甜菜再生體系基礎(chǔ)上，對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了穩(wěn)定的甜菜子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化體系，獲得轉(zhuǎn)RIPs基因的甜菜植株，為甜菜抗病分子育種提供了基礎(chǔ)材料和理論依據(jù)。目前取得的主要研究結(jié)果如下： 1、利用PCR方法從

3、玉米幼苗葉片總DNA中克隆到RIPs基因，并進(jìn)行序列測(cè)定。該基因全長(zhǎng)953bp,與文獻(xiàn)報(bào)道的核苷酸序列具有99.90％的同源性，氨基酸同源性為100％； 2、通過(guò)pMD18-T Vector 這一克隆載體的介導(dǎo)，將RIPs基因與質(zhì)粒pCAMBIA2301相連，構(gòu)建了以CaMV35S為啟動(dòng)子，以Tnos為終止子的植物雙元表達(dá)載體，該載體含有npt Ⅱ選擇標(biāo)記基因。 3、優(yōu)化了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甜菜子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化體系，結(jié)果顯示：將

4、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的農(nóng)桿菌重懸稀釋后調(diào)濃度OD<,600>值為0.4，子葉節(jié)外植體經(jīng)過(guò)24h預(yù)培養(yǎng)，侵染時(shí)間8min，共培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加100μM乙酰丁香酮，22℃～25℃共培養(yǎng)48～60h，經(jīng)過(guò)Cb抑菌和125mg/L的Kan篩選，有利于甜菜子葉節(jié)的遺傳轉(zhuǎn)化?？傻玫阶罡叩目剐匝柯?。 4、用液氮冷凍法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404，實(shí)現(xiàn)了核糖體失活蛋白(RIPs)基因?qū)μ鸩说倪z傳轉(zhuǎn)化，共獲得抗性植株38株，PCR檢測(cè)的陽(yáng)性植株11株