自體內(nèi)皮祖細(xì)胞移植對(duì)內(nèi)毒素致兔急性肺損傷生物學(xué)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合癥(ALI/ARDS)是各種致病因素導(dǎo)致的急性進(jìn)行性呼吸衰竭,是臨床常見急重癥.其死亡率在20世紀(jì)70年代早期高達(dá)70％以上,盡管近年來對(duì)其認(rèn)識(shí)及救治技術(shù)不斷提高,但總體病死率仍然在40％以上。國內(nèi)外學(xué)者對(duì) ARDS的治療進(jìn)行了大量研究并取得了一些進(jìn)展,但相關(guān)治療策略均只能在一定程度上緩解病情,并不能從根本上改善ARDS的不良預(yù)后。炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞與肺泡上皮細(xì)胞損傷是ARDS的特征性病理

2、改變,因此對(duì)受損肺臟進(jìn)行結(jié)構(gòu)修復(fù)和功能重建才是降低ARDS死亡率的理想治療方式.成體干細(xì)胞具有多向或單向分化潛能,取材方便,易于分離擴(kuò)增,并且不涉及到醫(yī)學(xué)倫理學(xué)的相關(guān)問題,因而在ALI/ARDS治療中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞,并且可參與出生后血管新生、再內(nèi)皮化和內(nèi)皮損傷后的修復(fù)。鑒于EPC作為內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制在維持內(nèi)皮細(xì)胞層完整性方面發(fā)揮了重要的作用,并且內(nèi)皮受損為ARDS早期的特征性病理改變之一,

3、因此EPC移植有希望成為ALI/ARDS的有效治療手段。本研究旨在了解ARDS動(dòng)物模型不同發(fā)病階段EPC的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律,觀察EPC自體移植以及EPC培養(yǎng)液“無細(xì)胞移植”對(duì)ARDS的生物作用并探討其可能的作用機(jī)制,為提出 ALI/ARDS治療新方法提供實(shí)驗(yàn)線索。
　　 方法：⑴從兔耳中央動(dòng)脈抽取外周血(10mL/Kg),以密度梯度法分離出單個(gè)核細(xì)胞(PMC),并將其接種于培養(yǎng)皿內(nèi)；使用添加了細(xì)胞因子和胎牛血清的內(nèi)皮祖細(xì)胞專用培養(yǎng)液

4、(EGM-2)進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)。首次換液時(shí)間為72小時(shí),其后每48小時(shí)換液一次。結(jié)果顯示,體外培養(yǎng)24小時(shí)后可見到單個(gè)核細(xì)胞粘附于培養(yǎng)皿底部。粘在第3天時(shí),部分細(xì)胞呈現(xiàn)出紡錘形變化,并且細(xì)胞分裂增殖明顯。此時(shí)更換培養(yǎng)液以除去未貼壁細(xì)胞和紅細(xì)胞。從第5天起,一部分單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為梭形的貼壁細(xì)胞,并且隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),圓形細(xì)胞的數(shù)量逐漸減少,而梭形細(xì)胞的數(shù)量逐漸增多.在第7天左右可觀察到成團(tuán)細(xì)胞形成的細(xì)胞集落。在第14天左右,細(xì)胞形狀變

5、為長(zhǎng)梭形,并且多角形細(xì)胞有融合趨勢(shì).吞噬功能和粘附功能實(shí)驗(yàn)顯示,體外培養(yǎng)的EPC可同時(shí)攝取Dil標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍?Dil-acLDL)并粘附FITC標(biāo)記的荊豆凝集素-1(FITC-UEA-1),熒光顯微鏡下雙陽性細(xì)胞的比率接近100％.通過免疫熒光對(duì)表面標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)顯示,95％以上的細(xì)胞同時(shí)表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(VEGFR2)和CD34。依據(jù)上述條件可認(rèn)定通過密度梯度離心后體外培養(yǎng)擴(kuò)增的細(xì)胞為早期EPC。⑵通過耳緣靜脈將

6、內(nèi)毒素(ET055:B5；500μg/Kg和700μg/Kg)注入新西蘭大白兔體循環(huán)內(nèi),72小時(shí)后活殺各組動(dòng)物并取肺組織進(jìn)行大體病理觀察.對(duì)兩組動(dòng)物的肺組織切片行HE染色顯示,兩組動(dòng)物均表現(xiàn)為不同程度的肺組織充血、微血管內(nèi)皮損傷、出血和以中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主的大量白細(xì)胞滲出、聚集；同時(shí)兩組動(dòng)物還出現(xiàn)肺泡間隔增厚、破壞以及部分肺泡萎陷不張等病理改變。上述結(jié)果提示兩組劑量?jī)?nèi)毒素均可成功建立ALI模型。與500μg/Kg劑量組相比,700μg/

7、Kg劑量組動(dòng)物的肺組織損傷程度相對(duì)較重,但早期死亡率過高,不利于進(jìn)行后期分析。因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用內(nèi)毒素500μg/Kg建立ALI動(dòng)物模型。⑶利用內(nèi)毒素(500μg/Kg)建立兔ALI模型,同時(shí)以等量生理鹽水注射設(shè)立對(duì)照組。分別在12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)和第5天抽取外周血.利用流式細(xì)胞儀測(cè)定外周血中VEGFR-2和CD34雙陽性細(xì)胞(EPC)的比率。體外培養(yǎng)細(xì)胞后測(cè)定 EPC的增殖、粘附和遷移功能。
　　 結(jié)果：①

8、對(duì)照組外周血EPC比率基本保持穩(wěn)定；模型組外周血EPC比率在內(nèi)毒素注射后即出現(xiàn)降低,24小時(shí)后降至最低點(diǎn),其后有所上升,但第5天時(shí)仍低于對(duì)照組。EPC增值、粘附和遷移功能均在內(nèi)毒素注射后出現(xiàn)降低,48小時(shí)后降至最低點(diǎn),其后有所上升,第5天時(shí)仍低于對(duì)照組；模型組在各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組相比均具有顯著差異。②CM-Dil標(biāo)記的EPC可定植于肺組織內(nèi).正常對(duì)照組各項(xiàng)指標(biāo)在各時(shí)間點(diǎn)均無顯著變化,并且與肺損傷對(duì)照組和EPC移植組相比均具有顯著差異(P<

9、0.01).EPC移植組肺組織病理切片的病變程度輕于肺損傷對(duì)照組,但病理評(píng)分無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異.與肺損傷對(duì)照組相比,EPC移植組的肺濕干比(W/D)和BALF蛋白含量降低,并且在3d和5d時(shí)具有顯著差異(P<0.05)；BALF中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)降低,并且在24h和3d時(shí)具有顯著差異(P<0.05)；肺組織髓過氧化物酶(MPO)活性降低,并且在3d時(shí)具有顯著差異(P<0.05)；IL-1β水平降低,并且在3d和5d時(shí)具有顯著差異(P<0.05

10、)；腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平降低,并且在24h和3d時(shí)具有顯著差異(P<0.05)；IL-10水平升高,并且在3d時(shí)具有顯著差異(P<0.05)；血清細(xì)胞間粘附分子1(ICAM-1)水平較低,并且在24h時(shí)具有顯著差異(P<0.05)；P選擇素mRNA水平降低,并且在3d時(shí)具有顯著差異(P<0.05)。EPC移植組的肺組織細(xì)胞凋亡數(shù)量少于肺損傷對(duì)照組,并且在5d時(shí)最為明顯。肺損傷對(duì)照組和EPC培養(yǎng)液組各項(xiàng)指標(biāo)與正常對(duì)照組相比均具

11、有顯著差異(P<0.01).EPC培養(yǎng)液組肺組織普通病理檢查所示的病變程度稍輕于肺損傷對(duì)照組.與肺損傷對(duì)照組相比,EPC培養(yǎng)液組肺W/D、BALF總蛋白含量、BALF中性粒細(xì)胞數(shù)量和肺組織MPO活性均較低,但各指標(biāo)均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P>0.05)。
　　 結(jié)論：⑴密度梯度離心聯(lián)合貼壁選擇法能夠成功從外周血中分離中EPC,并可在體外進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增。⑵在內(nèi)毒素構(gòu)建的兔ALI動(dòng)物模型中,外周血EPC數(shù)量以及增殖、粘附和遷徙功能在

12、ALI早期均出現(xiàn)顯著降低；隨著肺部炎癥的消退,EPC數(shù)量和相關(guān)功能有所恢復(fù)。⑶來源于外周血的自體EPC于移植后可歸巢到受損肺臟,并且可減輕內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肺損傷病變嚴(yán)重程度。自體EPC移植可通過降低ICAM-1和P-選擇素表達(dá)的方式減少ALI起始階段的PMN肺內(nèi)扣押,進(jìn)而預(yù)防肺損傷。自體EPC移植可將內(nèi)毒素誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子反應(yīng)部分轉(zhuǎn)化為抗炎細(xì)胞因子反應(yīng),同時(shí)可還可通過減少肺組織細(xì)胞凋亡發(fā)揮治療作用.EPC培養(yǎng)液移植可在一定程度上減輕內(nèi)