內(nèi)皮祖細(xì)胞移植修復(fù)肺血管內(nèi)皮炎癥損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景與目的：
　　 急性肺損傷(acute lung injury,ALI)和急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distresssyndrome,ARDS)是臨床常見(jiàn)的疾病,是由感染、創(chuàng)傷、中毒、失血等病因?qū)е碌娜硎Э匦匝装Y反應(yīng),以肺血管內(nèi)皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞廣泛壞死、凋亡及功能失調(diào),肺泡--毛細(xì)血管膜損傷、通透性增加、肺內(nèi)大量蛋白和炎癥細(xì)胞因子滲出為其臨床病理特征[1～3],其發(fā)病率和死亡率高;文獻(xiàn)報(bào)道

2、ALI/ARDS中有近50％肺血管受損及功能失調(diào)[4,5]。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是一類可以分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞,不僅參與人胚胎血管的形成,同時(shí)也參與出生后血管形成、再內(nèi)皮化和組織損傷后的修復(fù)過(guò)程。隨著內(nèi)皮祖細(xì)胞移植在心血管疾病、缺血性損傷、抗腫瘤血管生成中的研究、應(yīng)用[6,7],近年來(lái)國(guó)外學(xué)者開(kāi)始探索EPCs在炎癥疾病中的作用。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)在肺炎、膿毒癥患者外周血中EP

3、Cs數(shù)量顯著增加,且與預(yù)后成正相關(guān)。Suratt[8]等報(bào)道在接受異體供體的造血干細(xì)胞移植后,受體的肺組織可檢測(cè)到供體衍生的內(nèi)皮細(xì)胞,且內(nèi)皮細(xì)胞嵌合的發(fā)生率為37.5％～42.3％;這些研究提示,EPCs對(duì)維持炎癥組織、維持血管的完整和重建具有重要作用,為ALI/ARDS的治療提供了新的思路。
　　 本實(shí)驗(yàn)采用密度梯度離心的方法,經(jīng)體外培養(yǎng)、鑒定,成功分離出大鼠的骨髓EPCs;以此為基礎(chǔ),在LPS誘導(dǎo)的雌性大鼠ALI模型中,經(jīng)靜

4、脈移植同種異體的雄性的EPCs,通過(guò)原位雜交、RT-PCR方法檢測(cè)Y染色體來(lái)檢測(cè)EPCs在雌性肺組織中的嵌合情況,同時(shí)觀察對(duì)肺組織的病理結(jié)構(gòu)及肺血管膜通透性的影響,并采用ELISA、Western blot檢測(cè)移植EPCs后對(duì)細(xì)胞因子TNF-α、IL-10及對(duì)內(nèi)皮素-1(endothelin-1,ET-1)、誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthetase,iNOS)的影響,以探討EPCs在ALI

5、/ARDS治療中的作用,為ALI/ARDS的內(nèi)皮細(xì)胞靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法
　　 1、分離、培養(yǎng)、鑒定EPCs:采用密度梯度離心法分離SD大鼠的骨髓EPCs,接種在纖維連接蛋白包被的含20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)7～10天后采用免疫熒光檢測(cè)EPCs攝取乙酰化低密度脂蛋白、結(jié)合凝集素的能力,并檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞特異性抗原CD133、CD34、VEGFR-2、vWF的表達(dá)來(lái)鑒定EPCs。

6、>　　 2、用Y染色體特異性基因sry來(lái)檢測(cè)大鼠骨髓EPC移植后在肺組織中的表達(dá)及定位:ALI模型通過(guò)LPS靜脈給藥誘導(dǎo),致傷半小時(shí)后,EPC移植組雌性大鼠經(jīng)右側(cè)頸靜脈注入同遺傳背景的雄性大鼠來(lái)源的EPCs懸液(2×106/0.5ml),分別于移植后3,7,14天取肺組織,采用ISH和RT-PCR方法檢測(cè)各組肺組織中Y染色體的sry基因的表達(dá)。
　　 3、探討EPC移植對(duì)肺血管內(nèi)皮炎癥損傷的修復(fù)作用:在另一實(shí)驗(yàn)中,動(dòng)物隨機(jī)分為

7、四組:PBS對(duì)照組、EPC對(duì)照組、PBS處理組和EPC處理組;EPC處理組和PBS處理組在LPS致傷后分別給予EPCs或等量的PBS;EPC對(duì)照組和PBS對(duì)照組則分別給予EPCs或PBS,但不給與LPS誘導(dǎo)肺損傷;7天后取各組肺組織,采用HE染色、免疫組織化學(xué)的方法評(píng)估EPC移植后的病理改變及微血管密度的變化;并檢測(cè)肺組織的干/濕比值(W/D)及大鼠的存活率,細(xì)胞因子IL-10、TNF-α的表達(dá)水平,同時(shí)采用Western blot方法

8、評(píng)估ALI的生物標(biāo)記物ET-1、iNOS的表達(dá)。
　　 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:所得結(jié)果用醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測(cè)定其灰度值,所得數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。用SPSS13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,兩組間比較用t檢驗(yàn);多組間進(jìn)行單因素方差分析,用Tukey's方法進(jìn)行組間比較。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P＜0.01表示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異非常顯著。
　　 結(jié)果
　　 1.鑒定EPCs:培養(yǎng)7天后,早期的EPCs能攝取

9、乙?；兔芏戎鞍住⒔Y(jié)合凝集素,并表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞特異性的標(biāo)志物CD133、CD34、vWF和VEGFR-2;在含20％胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)一周后能形成圓形、梭形的細(xì)胞表型。
　　 2.在細(xì)胞移植7天組和14天組的ALI雌性大鼠的肺組織中分別可檢測(cè)到雄性來(lái)源的同種異體的EPCs,且EPCs主要定位在內(nèi)皮系統(tǒng);但在細(xì)胞移植3天組ALI雌性大鼠肺組織中未檢測(cè)到雄性來(lái)源的同種異體的EPCs。
　　 3.EPC移植可顯著減少

10、炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)、肺組織出血及透明膜的形成,降低炎癥反應(yīng)狀態(tài);降低肺組織的肺W/D比值,減輕肺水腫;同時(shí)促進(jìn)血管生成,增加微血管密度,改善ALI大鼠的存活率;增加抗炎細(xì)胞因子IL-10的表達(dá);同時(shí)下調(diào)TNF-α、ET-1和iNOS的表達(dá)。
　　 結(jié)論
　　 本研究主要結(jié)論:1、采用密度梯度離心法,經(jīng)體外培養(yǎng)、鑒定,成功分離出大鼠的骨髓EPCs2、EPC靜脈移植7天后能成功嵌合到LPS致傷的大鼠肺組織,并分化為內(nèi)皮表型;3、