缺氧和福美雙對藏雞和肉雞脛骨血管化的作用機制及其對脛骨生長的影響.pdf

1、脛骨軟骨發(fā)育不良(Tibial dyschondroplasia，TD)是一種家禽的營養(yǎng)代謝性腿部疾病，主要在脛骨干骺端的肥大軟骨細胞區(qū)出現(xiàn)非血管化和非鈣化的不成熟的軟骨細胞堆積在生長板，表現(xiàn)為軟骨內(nèi)骨化的異常。在1965年，該病最先在美國被Leach RM和MC Nesheim在青年肉雞上發(fā)現(xiàn)并報道，隨后在火雞和鴨等家禽上也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，臨床主要表現(xiàn)為不愿站立，腿部骨骼變形，行動緩慢并常常以雙翅來輔助行走，嚴重者喪失行走能力，影響采食。禽

2、類TD病在世界各國呈廣泛分布，沒有區(qū)域集中性或特意高發(fā)性，每年給全世界禽類行業(yè)造成不可估量的經(jīng)濟損失。由于發(fā)病原因的復雜性，增加了研究其機理的難度性，肉雞發(fā)生TD的最根本的病因至今還不清楚。
　　藏雞(Tibetan chicken，TBC)主要生活在海拔2，200～4，100m的青藏高原農(nóng)牧地區(qū)，是世界上在高海拔低氧環(huán)境生活歷史最悠久的土著雞種，且至今未見有藏雞腿病的報道，這可能與其長期生活在高海拔低氧環(huán)境有關(guān)。研究指出肉雞TD

3、的發(fā)生與脛骨生長板血管生成的異常有關(guān)，而骨骼的形成過程都與血管生長的過程是緊密相關(guān)的。鑒于此，我們對高海拔藏雞和低海拔肉雞進行了對比研究，并驗證高海拔低氧環(huán)境對低海拔肉雞的脛骨生長發(fā)育的影響，也對肉雞TD的發(fā)生是否與脛骨生長板血管生長抑制有關(guān)作進一步研究，同時更深入的研究肉雞發(fā)生TD時，脛骨生長板血管生長過程是如何調(diào)控的以及血管生成的減少如何影響脛骨的生長和發(fā)育。主要研究內(nèi)容如下:
　　1.藏雞與肉雞在生產(chǎn)性能和骨骼發(fā)育上的對比研

4、究
　　與生活在低海拔肉雞相比，藏雞在骨骼生長方面是否存在什么特殊之處至今仍很大的未知。在同一月份內(nèi)，120只1日齡健康高海拔TBC和低海拔愛拔益加肉雞(Arbor Acres chicken，AAC)分別在兩地進行飼養(yǎng)。結(jié)果顯示:TBC的采食量、日增重和體重，以及脛骨的重量、脛骨的長度和脛骨生長板的寬度均顯著低于低海拔AAC(p＜0.05)。然而，脛骨的組織病理觀察到藏雞脛骨生長板區(qū)域血管的分布明顯增多。qRT-PCR結(jié)果顯示H

5、IF-1α、VEGFA以及其受體VEGFR1和VEGFR2在藏雞脛骨生長板上的表達量均顯著高于低海拔AAC(p＜005)。ELISA結(jié)果也顯示類似的改變，整個試驗期間藏雞血清VEGFA的蛋白含量均高于低海拔AAC。血清中VEGFR2和IL-8蛋白含量除了第7天低于AAC，在第3天、第10天和第14天均顯著高于AAC(p＞0.05)。這些結(jié)果表明，高海拔缺氧環(huán)境對TBC的身體和脛骨的生長是抑制的。但藏雞脛骨生長板區(qū)域分布豐富的血管，而且較

6、高血管生成調(diào)控基因HIF-1α、VEGFA以及其受體的表達，這可能就是TBC不發(fā)生TD的原因。
　　2.高海拔低氧環(huán)境對肉雞脛骨生長板上HIF-1α/VEGF/VEGFR信號通路表達的影響
　　藏雞是青藏高原上一個土著的地方雞種，能夠?qū)Ξ數(shù)貒揽岬母咴脱鹾?、低氣壓、高寒的環(huán)境有很好的適應性。并且通過之前的研究發(fā)現(xiàn)藏雞脛骨生長板區(qū)域擁有更豐富的血管分布，血管生長相關(guān)調(diào)控基因表達水平也較高。那么，高海拔低氧環(huán)境是否可以誘導脛骨

7、生長板更多的血管分布還未深入研究。因此，本實驗選取120只健康低海拔AAC，運輸?shù)礁吆０蔚貐^(qū)西藏進行飼養(yǎng)，分為自然低氧組和正常氧氣組進行試驗。結(jié)果顯示，在高海拔低氧環(huán)境下AAC的生產(chǎn)性能和體重都受到抑制，死亡率增加;另外，脛骨的重量和長度也不同程度受到抑制。然而，血液常規(guī)指標顯示在低氧環(huán)境下AAC在第14天出現(xiàn)的紅細胞（RBC）、血紅蛋白(Hb)和紅細胞壓積(Hct)增加。值得注意的是，脛骨的組織病理學分析顯示在自然低氧環(huán)境14天后AA

8、C脛骨生長板區(qū)域血管密度顯著增加。qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示肉雞在高海拔低氧的條件下，脛骨生長板上缺氧應激基因HIF-1α和血管生長相關(guān)基因VEGFA和VEGFR1的表達水平都有顯著的過表達。ELISA檢測血清蛋白含量進一步證實缺氧條件下可以增加血清中VEGFA、VEGFR2和IL-8的蛋白含量。這些結(jié)果說明，低海拔AAC生活在高海拔低氧環(huán)境下，可以通過調(diào)控機體缺氧應激基因HIF-1α和血管生長相關(guān)基因VEGFA和

9、它的受體的表達，促進脛骨生長板肥大軟骨細胞區(qū)血管分布的增加。
　　3.HIF-1α/VEGF/VEGFR信號通路在福美雙誘導的TD肉雞上的作用機制
　　TD是一種比較棘手的家禽腿病問題，組織病理顯示在脛骨近端的生長板上出現(xiàn)大面積的非血管化和非鈣化的“軟骨楔”為特征，導致骨骼鈣化不全，這可能與脛骨生長板血管生成異常有關(guān)。然而，血管生成抑制在肉雞TD發(fā)生中所扮演的角色仍然還不清楚。通過福美雙誘導肉雞發(fā)生TD期間觀察到肉雞發(fā)生跛行

10、，脛骨生長板增寬，呈白色的非血管區(qū)。對脛骨形態(tài)指標測量顯示脛骨的重量和長度減少，生長板寬度及生長板寬度系數(shù)增加。組織病理顯示AAC發(fā)生TD時，脛骨近端靜止區(qū)和增殖區(qū)血管的分布沒有顯著改變，而肥大軟骨細胞區(qū)血管的分布呈顯著的減少并且軟骨細胞大量死亡。另外，血常規(guī)指標也顯示AAC發(fā)生TD時，RBC、Hb和Hct都顯著減少。接下來通過qRT-PCR、Western blot和ELISA的方法分別檢測脛骨生長板上和肉雞血清中血管生成相關(guān)基因和蛋

11、白的表達情況，結(jié)果顯示:HIF-1α、VEGFA以及它的受體的基因表達和蛋白水平在第7天TD肉雞組都顯著的減少，并且這些基因的表達水平與脛骨生長板血管的分布呈極強的正相關(guān)?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)說明AAC發(fā)生TD時，機體可能是通過下調(diào)脛骨生長板上血管生成相關(guān)基因和蛋白HIF-1α、VEGFA以及它的受體的表達，從而抑制脛骨肥大軟骨細胞區(qū)血管的分布，導致家禽脛骨生長發(fā)育的抑制。
　　4.VEGF/FGF/Ang-1/PDGF-BB及其受體在

12、TD肉雞脛骨血管形成過程中的作用機制
　　先前的研究表明，骨骼是一種高度血管化的組織，并且依賴于血管生成與成骨形成之間的協(xié)調(diào)耦聯(lián)。既然血管生成的抑制和肉雞TD的發(fā)生具有極大的相關(guān)性，那么肉雞TD發(fā)生時，脛骨生長板肥大區(qū)血管形成過程是如何被調(diào)控的仍不清楚。研究結(jié)果顯示:AAC發(fā)生TD時，中胚層分化的標志性基因纖維母細胞生長因子2(FGF2)和受體FGFR1表達水平下降;血管島形成標志性基因血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和受體VEGFR

13、1\VEGR2的血清蛋白濃度被顯著降低;血管島成熟相關(guān)基因的調(diào)控包括血管生成素(Ang1，Ang2)以及它們的內(nèi)皮受體酪氨酸激酶Tie2等相關(guān)基因被抑制，這些或許將導致血管發(fā)生的推遲。另外，機體通過下調(diào)VEGFA和VEGFR1\VEGFR2受體基因和蛋白的表達，上調(diào)血小板源性生長因子(PDGF)-BB及受體PDGFR-β基因表達和血清蛋白水平的升高，導致脛骨生長板血管的異常增殖和成熟，血管生成的減少。總之，肉雞發(fā)生TD時，血管生成的抑制

14、可能是通過抑制血管發(fā)生和血管生成過程的相關(guān)調(diào)控基因和蛋白的表達，從而導致脛骨生長板上血管分布的減少。
　　5.OPG/RANKL信號通路在TD肉雞脛骨生長上的作用機制
　　TD肉雞血管形成的抑制勢必會影響骨的正常形成，那么骨生成過程發(fā)生怎樣的異常調(diào)控至今仍不清楚。研究結(jié)果顯示:與正常組AAC相比，肉雞發(fā)生TD時，肉雞的體重，脛骨的骨量、長度和中央直徑都顯著減少，并且體重與脛骨的骨量呈正相關(guān)。組織病理和形態(tài)學結(jié)果顯示TD肉雞脛

15、骨近端生長板肥大區(qū)血管分布顯著減少，軟骨細胞呈核固縮和核溶解，生長板寬度增加。血清生化結(jié)果顯示AAC發(fā)生TD時血清堿性磷酸酶(ALP)活性受到抑制，鈣磷平衡被破壞。另外，通過qRT-PCR和ELISA檢測脛骨生長板和血清中調(diào)控骨骼生成相關(guān)基因和蛋白發(fā)現(xiàn)TD肉雞脛骨生長板和血清中骨保護素(OPG)基因和蛋白的表達都顯著受到抑制，核因子κB受體活化因子配體(RANKL)表達水平上調(diào)，這將促進其受體核因子-κB受體活化因子(RNAK)信號的激

16、活。并且OPG的水平與脛骨生長板上血管的分布以及脛骨的生長呈正相關(guān)，RANKL呈負相關(guān)。這些結(jié)果說明肉雞TD發(fā)生時，脛骨近端血管浸入的減少導致軟骨細胞的死亡影響骨架的延伸，同時死亡軟骨細胞在生長板肥大軟骨細胞的堆積，在生長板處形成嚴重的損傷區(qū)域。另外，肥大軟骨細胞區(qū)血管侵入的減少，血清鈣磷水平的失調(diào)影響肥大區(qū)軟骨基質(zhì)的鈣化。基因水平進一步說明，促進骨形成的OPG基因被抑制，而RNAKL基因的上調(diào)，促進RNAK信號激活破骨細胞的骨吸收功能

17、，從而影響骨的轉(zhuǎn)化，導致骨量的減少。
　　總之，試驗通過對藏雞的研究首次揭示藏雞不發(fā)生脛骨軟骨發(fā)育不良的生理機制可能是通過長期的高海拔低氧環(huán)境適應，上調(diào)HIF-1α，VEGF以及其受體基因的表達，提高脛骨生長板上血管的侵入有關(guān);而且，高海拔缺氧環(huán)境對肉雞的影響進一步證實這一作用機制。另外，福美雙誘導的肉雞TD模型顯示脛骨生長板上VEGF以及其受體VEGFR1和VEGFR2基因的異常表達，抑制脛骨生長板血管化與肉雞TD發(fā)生存在極強的