調(diào)控巨噬細(xì)胞極化抗小鼠日本血吸蟲病肝纖維化的實驗研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面展開論述：
　　第一部分：探討SEA及γ分泌酶阻斷劑對巨噬細(xì)胞極化方向的影響及細(xì)胞Notch信號通路的表達(dá)情況
　　目的：培養(yǎng)巨噬細(xì)胞RAW264.7，探討日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原（SEA，soluble egg antigen）及γ分泌酶阻斷劑DAPT對其極化方向的影響，以及Notch1/Jagged1信號通路的激活情況并分析SEA作用的時間、劑量依賴性。
　　方法：培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞，經(jīng)過

2、SEA不同濃度和不同時間作用后，通過PCR、Western blot方法檢測Notch1、Jagged1、Hes1等Notch信號通路相關(guān)基因及蛋白表達(dá)，Elisa、Western blot方法檢測IL-10、IL-12、Arg-1、NOS-2等細(xì)胞極化方向的相關(guān)指標(biāo)表達(dá)。γ分泌酶阻斷劑DAPT作用于RAW264.7細(xì)胞后，SEA繼續(xù)作用于細(xì)胞，同上方法分別檢測Notch信號通路及細(xì)胞極化方向的指標(biāo)。
　　結(jié)果：SEA作用于RAW

3、264.7細(xì)胞后：（1）Notch1/Jagged1信號通路的相關(guān)指標(biāo)如Notch1、Jagged1、Hes1等在mRNA及蛋白質(zhì)水平表達(dá)較對照組均升高明顯，且SEA的作用有時間-劑量依賴性，在SEA濃度為40ug/ml，時間為2小時時，上述指標(biāo)升高最為明顯；（2）在細(xì)胞極化方向，結(jié)果顯示，M2極化方向的指標(biāo)如Arg-1、IL-10對照組表達(dá)升高，而M1極化指標(biāo)如NOS-2、IL-12對照組表達(dá)下降。γ分泌酶阻斷劑DAPT作用于RAW2

4、64.7細(xì)胞后：（3）Notch1/Jagged1信號通路的相關(guān)指標(biāo)如Notch1、Jagged1、Hes1較對照組表達(dá)下降；（4）在細(xì)胞極化方向，結(jié)果顯示，M2極化方向的指標(biāo)如Arg-1、IL-10對照組表達(dá)下將，M1方向的極化指標(biāo)NOS-2、IL-12對照組表達(dá)升高。
　　結(jié)論：SEA可激活RAW264.7細(xì)胞的Notch1/Jagged1信號通路，促使細(xì)胞向M2方向極化，并且其作用呈時間-劑量依賴性。γ分泌酶阻斷劑DAPT可

5、阻斷RAW264.7細(xì)胞的Notch1/Jagged1信號通路，逆轉(zhuǎn)細(xì)胞向M2方向極化。
　　第二部分：建立小鼠血吸蟲肝纖維化模型并探討γ分泌酶阻斷劑對模型小鼠肝肉芽腫和纖維化的影響
　　目的：建立小鼠血吸蟲肝纖維化模型，研究該模型中浸潤的巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出的極化方向，并探討γ分泌酶阻斷劑DAPT對肝纖維化的影響及其主要機制。
　　方法：（1）建立小鼠血吸蟲肝纖維化模型。16只健康成年雌性Balb/c小鼠分為兩組，一組為模

6、型組，經(jīng)皮感染日本血吸蟲尾蚴，另一組為對照組，用PBS處理。感染8周后，分別處死兩組小鼠，激光共聚焦法檢測兩組小鼠肝臟組織中F4/80、Arg-1、CD206的表達(dá)。（2）24只健康成年雌性Balb/c小鼠分為3組：對照組，模型組和DAPT干預(yù)組。模型組和DAPT干預(yù)組小鼠經(jīng)皮感染日本血吸蟲尾蚴，8周后DAPT干預(yù)組小鼠經(jīng)腹腔注射DAPT（10mg/kg）每日一次。DAPT干預(yù)4周后，同時處死三組小鼠。蘇木精-伊紅染色和Masson三色

7、染色法觀察每個實驗組小鼠肝臟情況，包括蟲卵肉芽腫的平均大?。╩m）及MOD半定量法檢測膠原纖維的表達(dá)情況；激光共聚焦法檢測小鼠肝臟組織中F4/80、Arg-1的表達(dá)；羥脯氨酸試劑盒檢測小鼠肝臟組織中羥脯氨酸的含量。
　　結(jié)果：（1）激光共聚焦顯微鏡下可見模型組小鼠肝組織中表達(dá)F4/80的細(xì)胞聚集較對照組小鼠增多，同時這些細(xì)胞也表達(dá)Arg-1和CD206。（2）DAPT干預(yù)組小鼠肝組織中同時表達(dá)F4/80和Arg-1的細(xì)胞減少；DA