瘦素在日本血吸蟲病肝纖維化中的作用及分子機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分
　　 目的：構(gòu)建穩(wěn)定的、類似人類日本血吸蟲病肝纖維化自然病程的小鼠日本血吸蟲病肝纖維化模型，觀察小鼠日本血吸蟲病肝纖維化形成的動(dòng)態(tài)過程，為探討日本血吸蟲病肝纖維化發(fā)病機(jī)制和干預(yù)性實(shí)驗(yàn)用藥時(shí)機(jī)的選擇及療效觀察提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：血吸蟲尾蚴敷貼法感染小鼠，模型組分別于感染日本血吸蟲尾蚴后2 wk、4 wk、6 wk、8 wk、12 wk、16 wk、20 wk、24 wk，采用常規(guī)HE染色及透射電子顯微鏡檢

2、查對(duì)肝組織進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，常規(guī)Van Gieson染色觀察感染不同時(shí)期肝臟膠原分布部位和含量以及肝纖維化程度的動(dòng)態(tài)變化。
　　 結(jié)果：HE和VG染色顯示小鼠日本血吸蟲病肝纖維化模型建立成功，病理證實(shí)小鼠日本血吸蟲感染成功率100％，完成實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物肝纖維化成功率100％。日本血吸蟲感染后第6 wk，急性蟲卵肉芽腫形成，第8 wk時(shí)肉芽腫達(dá)到高峰，電鏡下，肉芽腫周圍的肝細(xì)胞內(nèi)有脂滴形成，發(fā)生變性、壞死。之后大部分被吸收而變?yōu)榫哂?/p>

3、增殖活性的假結(jié)核性蟲卵肉芽腫，體積逐漸減小，至感染后第20～24 wk，呈現(xiàn)血吸蟲病特有的干線型肝纖維化。日本血吸蟲感染第8 wk后，在肝臟蟲卵肉腫內(nèi)及周圍可見少量膠原纖維分布；隨后，肝臟組織膠原含量和肝纖維化程度隨病程發(fā)展呈進(jìn)行性增多或加重。
　　 結(jié)論：日本血吸蟲尾蚴感染的小鼠日本血吸蟲病肝纖維化模型成功再現(xiàn)了人類日本血吸蟲病肝纖維化發(fā)病的自然進(jìn)程，為進(jìn)一步探討日本血吸蟲病肝纖維化發(fā)病機(jī)制和抗肝纖維化治療奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

4、r>　　 第二部分
　　 目的：觀察小鼠感染日本血吸蟲后不同時(shí)期肝臟瘦素長受體(OB-Rb)mRNA和蛋白動(dòng)態(tài)表達(dá)，探討瘦素及其受體在日本血吸蟲病肝纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　 方法：日本血吸蟲尾蚴皮膚敷貼法感染小鼠構(gòu)建日本血吸蟲病肝纖維化模型，于感染后不同時(shí)間取肝臟標(biāo)本。HE和VG染色對(duì)肝組織進(jìn)行病理學(xué)檢查，免疫組織化學(xué)SP法動(dòng)態(tài)觀察OB-Rb及肝星狀細(xì)胞(HSC)標(biāo)記物α-平滑肌動(dòng)蛋白(α-SMA)表達(dá)；逆轉(zhuǎn)錄-

5、聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測OB-Rb mRNA動(dòng)態(tài)表達(dá)。
　　 結(jié)果：α-SMA和OB-Rb蛋白陽性表達(dá)隨病程進(jìn)展進(jìn)行性增加，二者共表達(dá)于膠原纖維沉積處；模型組OB-Rb mRNA在感染4 wk開始表達(dá)，隨病程進(jìn)展逐漸增高，持續(xù)至24 wk。相關(guān)分析表明，α-SMA蛋白表達(dá)與膠原含量(r=0.956，P<0.01)及肝纖維化程度(r=0.804，P<0.01)均呈正相關(guān)；OB-Rb蛋白和mRNA表達(dá)與膠原含量(r=0.96

6、5，P<0.01;r=0.945，P<0.01)及肝纖維化程度(r=0.823，P<0.01；r=0.880，P<0.01)均呈正相關(guān)。
　　 結(jié)論：瘦素、HSC和日本血吸蟲病肝纖維化之間有著極為密切的關(guān)系，HSC是日本血吸蟲病肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵細(xì)胞，而瘦素可能是日本血吸蟲病肝纖維化形成過程中一個(gè)新的促肝纖維化因子。
　　 第三部分
　　 目的：觀察小鼠感染日本血吸蟲后不同時(shí)期肝臟瘦素和磷脂酰肌醇-3激

7、酶(PI3K)蛋白及α1(I)型前膠原 mRNA在日本血吸蟲病肝纖維化形成過程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)，研究PI3K通路在瘦素促進(jìn)日本血吸蟲病肝纖維化過程中的作用，初步闡明瘦素致日本血吸蟲病肝纖維化的分子機(jī)制。
　　 方法：日本血吸蟲尾蚴皮膚敷貼法感染小鼠構(gòu)建日本血吸蟲病肝纖維化模型，于感染后不同時(shí)間取肝臟標(biāo)本。HE和VG染色對(duì)肝組織進(jìn)行病理學(xué)檢查，免疫組織化學(xué)SP法動(dòng)態(tài)觀察瘦素和PI3K蛋白表達(dá)；Western Blot法分析PI3K蛋白

8、的動(dòng)態(tài)表達(dá)；RT-PCR檢測α1(I)型前膠原 mRNA動(dòng)態(tài)表達(dá)。
　　 結(jié)果：瘦素和PI3K蛋白陽性表達(dá)隨病程進(jìn)展進(jìn)行性增加，二者共表達(dá)于膠原纖維沉積處；模型組PI3K在感染4 wk開始表達(dá)，隨病程進(jìn)展逐漸增高，持續(xù)至24 wk。相關(guān)分析表明，瘦素蛋白表達(dá)與肝臟膠原含量(r=0.758，P<0.01)、α1(I)型前膠原 mRNA(r=0.832，P<0.01)及肝纖維化程度均呈正相關(guān)(r=0.823，P<0.01)；PI3K

9、蛋白表達(dá)與瘦素蛋白(r=0.882，P<0.01)、肝臟膠原含量(r=0.889，P<0.01)、α1(I)型前膠原 mRNA(r=0.708，P<0.01)及肝纖維化程度(r=0.807，P<0.01)均呈正相關(guān)；α1(I)型前膠原mRNA與膠原含量(r=0.824，P<0.01)、肝纖維化程度均呈正相關(guān)(r=0.612，P<0.01)。
　　 結(jié)論：瘦素通過增強(qiáng)PI3K磷酸化，而促進(jìn)α1(I)型前膠原 mRNA表達(dá)和膠原合成

10、，進(jìn)而促進(jìn)日本血吸蟲病肝纖維化的形成，PI3K通路在該過程中發(fā)揮重要作用。
　　 第四部分
　　 目的：觀察維生素E(VitE)對(duì)α-SMA、瘦素和PI3K蛋白以及α1(I)型前膠原基因表達(dá)的影響，探討VitE抗小鼠日本血吸蟲病肝纖維化作用及其機(jī)制。
　　 方法：日本血吸蟲尾蚴皮膚敷貼法感染小鼠構(gòu)建日本血吸蟲病肝纖維化模型，以肝纖維化達(dá)Ⅱ級(jí)或Ⅱ級(jí)以上作為開始治療的標(biāo)志。隨機(jī)分5組：正常對(duì)照組、模型組以及VitE高

11、、中、低劑量組(150 mg/kg、50 mg/kg、5 mg/kg)。于第8 wk末處死動(dòng)物，HE和VG染色以及透射電子顯微鏡對(duì)肝組織進(jìn)行病理學(xué)檢查，應(yīng)用分光光度法檢測肝組織丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性，采用免疫組織化學(xué)SP法檢測HSC標(biāo)記物α-SMA和瘦素蛋白表達(dá)情況，Western Blot方法分析PI3K蛋白表達(dá)情況，RT-PCR方法檢測肝臟α1(I)型前膠原基因表達(dá)。
　　 結(jié)果：VitE降低模型

12、組肝組織MDA含量(P<0.01)，提高SOD活性(P<0.01)；減少α-SMA和瘦素陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)(P<0.01)；降低肝臟PI3K蛋白表達(dá)(P<0.01)、膠原含量(P<0.01)和α1(I)型前膠原基因表達(dá)(P<0.01)，均呈劑量效應(yīng)關(guān)系。
　　 結(jié)論：VitE具有抗小鼠日本血吸蟲病肝纖維化作用，其機(jī)制與VitE抗脂質(zhì)過氧化作用、抑制HSC活化和增殖、抑制瘦素表達(dá)、阻斷PI3K通路、降低α1(I)型前膠原基因表達(dá)和膠原