PTEN調(diào)控肝纖維化小鼠肝臟巨噬細(xì)胞極化及相關(guān)機(jī)制的研究.pdf

1、背景：肝纖維化（hepatic fibrosis）是各種病因所致慢性肝損傷的持續(xù)性病理修復(fù)過程，表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）沉積。持續(xù)的肝纖維最終可能會(huì)導(dǎo)致肝硬化甚至肝癌。肝臟中固有的巨噬細(xì)胞稱為枯否細(xì)胞（Kupffer cell，KCs），KCs分泌細(xì)胞因子促進(jìn)HSC的活化是肝纖維化發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵事件。研究表明，在肝纖維化進(jìn)程中，KCs能夠極化分型為經(jīng)典激活巨噬細(xì)胞（M1型）和替代激活巨噬細(xì)胞（M2型）發(fā)揮調(diào)控作用。其中M2型巨噬細(xì)胞能

2、分泌促纖維化因子IL-10、TGF-β等進(jìn)而促進(jìn)纖維化形成。探討肝纖維化過程中KCs極化的調(diào)控規(guī)律，是防治肝纖維化的重要方法之一。
　　第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物基因(phosphates and tensing homologue deleted on chromosome10，PTEN)是一種腫瘤抑制因子，其編碼的蛋白具有雙重特異性磷酸酶活性，能通過負(fù)調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路參與調(diào)控機(jī)體固有免疫。PTEN在

3、肝纖維化病程中發(fā)揮重要作用，但其作用機(jī)制還不明確。有研究發(fā)現(xiàn)，PTEN在腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞和脂肪組織相關(guān)巨噬細(xì)胞極化中發(fā)揮重要作用。PTEN是否通過調(diào)控KCs極化參與肝纖維化病程，還未見文獻(xiàn)報(bào)道。本課題擬以肝纖維化形成與逆轉(zhuǎn)小鼠模型為研究對(duì)象，研究PTEN對(duì)肝臟巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控作用及其可能的作用機(jī)制。
　　方法：在體實(shí)驗(yàn)，10%四氯化碳(CCl4)皮下注射C57BL/6小鼠，連續(xù)8周，每周兩次，為肝纖維化進(jìn)展組；停止注射，自然恢復(fù)

4、8周為肝纖維化逆轉(zhuǎn)組。取各時(shí)期肝臟組織和原代肝臟巨噬細(xì)胞(KCs)，檢測(cè)肝臟病理變化及肝纖維化相關(guān)指標(biāo)，確立肝纖維化進(jìn)展及逆轉(zhuǎn)模型建立成功。采用免疫組化、RT-qPCR和Western Blot方法檢測(cè)肝纖維化進(jìn)展及逆轉(zhuǎn)小鼠肝臟巨噬細(xì)胞是否發(fā)生極化分型，接著檢測(cè)小鼠肝臟巨噬細(xì)胞中PTEN表達(dá)的變化。
　　離體實(shí)驗(yàn)，LPS和IL-4誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7極化分型，通過RT-qPCR、Western Blot和免疫熒光染色檢

5、測(cè)不同極化分型中PTEN表達(dá)的變化。然后轉(zhuǎn)染siPTEN和pEGFP-N1-PTEN進(jìn)細(xì)胞，RT-qPCR、Western Blot、ELISA、免疫熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)巨噬細(xì)胞極化標(biāo)志物的變化。同時(shí)檢測(cè)Akt、p-Akt、STAT6和p-STAT6的表達(dá)變化確定PTEN與PI3K/Akt/STAT6信號(hào)通路的關(guān)系。LY294002是PI3K/Akt的特異性阻斷劑，RT-qPCR、Western Blot和ELISA方法檢測(cè)LY

6、294002處理對(duì)巨噬細(xì)胞極化標(biāo)志物表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：在體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肝纖維化進(jìn)展及逆轉(zhuǎn)期小鼠KCs極化分型為混合的M1和M2型。且肝纖維化進(jìn)展組KCs中PTEN表達(dá)逐漸降低，而逆轉(zhuǎn)期則逐漸升高并接近正常水平。體外RAW264.7細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)M2型細(xì)胞中PTEN表達(dá)降低。轉(zhuǎn)染siPTEN結(jié)果發(fā)現(xiàn)PTEN表達(dá)降低能明顯增加M2型標(biāo)志物表達(dá)，而過表達(dá)PTEN則顯著減少M(fèi)2型標(biāo)志物表達(dá)。PTEN表達(dá)減少，磷酸化的Akt和磷酸化的STAT