白藜蘆醇聯(lián)用紫杉醇對人食管鱗癌EC109細(xì)胞的影響.pdf

1、目的：
　　研究在人食管鱗癌 EC109細(xì)胞株中白藜蘆醇對紫杉醇抗腫瘤作用的影響并探討其機(jī)制，為臨床指導(dǎo)食管癌患者合理用藥提供相關(guān)的用藥依據(jù)。
　　方法：
　　實(shí)驗(yàn)分為四組，即陰性對照組、紫杉醇單用組、白藜蘆醇單用組和兩藥聯(lián)用組。
　　1.采用MTT法檢測白藜蘆醇聯(lián)合紫杉醇對細(xì)胞存活率的影響，同時顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化；
　　2.采用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測藥物處理后，各組細(xì)胞增殖能力的差異；
　　3.

2、 Hoechst33258染色法檢測藥物處理后，各組細(xì)胞凋亡情況；
　　4.采用流式細(xì)胞術(shù)分析藥物處理后，細(xì)胞周期分布以及凋亡率；
　　5.采用Western blot法考察藥物處理后，白藜蘆醇影響紫杉醇抗腫瘤作用的機(jī)制；
　　6.通過HPLC法檢測細(xì)胞內(nèi)紫杉醇的含量；
　　7.通過Rh123排出實(shí)驗(yàn)檢測聯(lián)合用藥后對細(xì)胞外排功能的影響；
　　8.采用裸鼠移植瘤模型研究白藜蘆醇對紫杉醇體內(nèi)抗腫瘤活性的影響。<

3、br>　　結(jié)果：
　　1.紫杉醇和白藜蘆醇分別作用于EC109細(xì)胞48 h后，紫杉醇和白藜蘆醇對細(xì)胞增殖均有一定的抑制作用，并且隨濃度的增加，它們對細(xì)胞增殖的抑制率也逐漸增加。當(dāng)一系列濃度的紫杉醇與一系列濃度的白藜蘆醇聯(lián)合作用，細(xì)胞生存率明顯高于紫杉醇單用組。MTT實(shí)驗(yàn)的測定結(jié)果顯示，白藜蘆醇減弱了紫杉醇的抑制細(xì)胞增殖的作用。
　　2.克隆形成實(shí)驗(yàn)表明，單用紫杉醇作用于 EC109細(xì)胞幾乎無克隆形成，當(dāng)紫杉醇和白藜蘆醇聯(lián)用后

4、，EC109細(xì)胞克隆形成能力明顯增強(qiáng)。
　　3. Hoechst33258染色后，熒光顯微鏡下觀察：紫杉醇作用24 h后，EC109細(xì)胞出現(xiàn)凋亡小體，呈現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)。同時加入白藜蘆醇后可見凋亡小體、核裂解數(shù)量減少。
　　4.流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡的結(jié)果顯示，紫杉醇和白藜蘆醇單用可誘導(dǎo)部分細(xì)胞凋亡，凋亡率分別為（39.8±6.95）％和(14.1±3.11）%。兩藥聯(lián)用后，與紫杉醇單用相比，凋亡率明顯下降，凋亡率為(2

5、2.0±4.89）%。流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期結(jié)果顯示，單用紫杉醇和白藜蘆醇分別可不同程度地誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生G2/M期和S期阻滯。兩藥聯(lián)用后，與單用紫杉醇相比，G2/M期比例下降，說明白藜蘆醇降低了紫杉醇對G2/M期的細(xì)胞周期阻滯作用。
　　5. Western blot實(shí)驗(yàn)檢測了EC109細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，如P-gp、P53、caspase-3、caspase-9、Procaspase-3、Procaspase-9、Bcl-2

6、和Bax等。紫杉醇聯(lián)用白藜蘆醇之后，跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-gp在聯(lián)合用藥時較紫杉醇單用組表達(dá)量升高了，P53蛋白的表達(dá)量較紫杉醇單用組明顯降低，Bcl-2/Bax的比率升高，caspase-9通過自剪接激活減少，引起細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者caspase-3的表達(dá)量也減少了。
　　6. HPLC法檢測細(xì)胞內(nèi)紫杉醇的含量發(fā)現(xiàn)兩藥聯(lián)合作用組較紫杉醇單用組紫杉醇在細(xì)胞內(nèi)的積累量減少了。
　　7. Rhl23蓄積實(shí)驗(yàn)中經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測合用組的平均

7、熒光強(qiáng)度明顯低于紫杉醇單用組，因此，紫杉醇與白藜蘆醇聯(lián)合應(yīng)用較紫杉醇單獨(dú)用藥細(xì)胞的外排功能增強(qiáng)了。
　　8.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，在裸鼠體內(nèi)，白藜蘆醇減弱了紫杉醇的抗腫瘤作用。
　　結(jié)論：
　　在人食管鱗癌細(xì)胞株 EC109中，白藜蘆醇減弱了紫杉醇抑制細(xì)胞增殖的作用，其機(jī)制可能與紫杉醇聯(lián)用白藜蘆醇之后，通過上調(diào)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)糖蛋白P-gp的表達(dá)，使紫杉醇的外排增加，細(xì)胞內(nèi)紫杉醇的濃度降低，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡減少。同時還介導(dǎo)了細(xì)胞凋亡的