白藜蘆醇對HepG2細(xì)胞的影響及機制探討.pdf

1、原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全世界最常見的惡性腫瘤之一，在我國位于癌癥死亡率的第二位。近年來，雖然我國的HCC治療取得了長久的進(jìn)步，其早期診斷率、手術(shù)切除率、術(shù)后生存率及生存質(zhì)量均有較大提高，但是目前HCC的發(fā)病率及死亡率仍占癌癥的第二位。
　　 HCC的治療方法的選擇取決于腫瘤的分期及肝功能情況，對不能手術(shù)切除及不能耐受手術(shù)者，可以采取腫瘤的局部及全身治療相結(jié)合的方法。但目前非手術(shù)治

2、療的療效有限。故尋找有效的治療藥物是提高存活率、降低復(fù)發(fā)率及改善生活質(zhì)量的重要手段，具有重要意義。
　　 白藜蘆醇(Resveratrol，Res)是一種非黃酮類多芬化合物，廣泛存在于植物。具有抗炎、抗氧化、保護(hù)心血管等作用。近年來各項研究表明，白藜蘆醇對體外培養(yǎng)的多種人類腫瘤細(xì)胞存在一定的抑制和細(xì)胞毒作用，如肝癌、胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等。其藥用已成為研究熱點，為此我們以肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞為研究對象，進(jìn)一步了解白藜蘆醇治療

3、肝癌的效果并探討其作用機制，為白藜蘆醇臨床治療肝癌提供理論基礎(chǔ)。
　　 第一章白藜蘆醇對肝癌HepG2細(xì)胞的影響
　　 目的:觀察白藜蘆醇對肝癌細(xì)胞HepG2的生長抑制、細(xì)胞毒作用，并分析其意義。
　　 方法:體外培養(yǎng)肝癌細(xì)胞株HepG2，分別采用不同濃度白藜蘆醇處理細(xì)胞，通過MTT法觀察HepG2細(xì)胞增殖情況，計算IC50，選擇最佳時間點和濃度進(jìn)行后續(xù)實驗，包括細(xì)胞形態(tài)觀察，MTT實驗檢測增殖能力和流式細(xì)胞儀檢

4、測凋亡比例。同時體外培養(yǎng)正常肝細(xì)胞LO2進(jìn)行對比。
　　 結(jié)果:
　　 (1) MTT法檢測白藜蘆醇對HepG2細(xì)胞增殖抑制，計算IC50:
　　 ①白藜蘆醇對HepG2細(xì)胞增殖具有抑制作用，并隨藥物濃度的增加而明顯增強(p＜0.01);同濃度72h、48h的細(xì)胞抑制率同24h比較升高，存在統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.01)，同濃度72h的細(xì)胞抑制率同48h比較升高，無統(tǒng)計學(xué)意義;
　　 ②測得24h、48h和7

5、2h的白藜蘆醇對HepG2細(xì)胞的IC50分別為77.02±5.13μg/ml、22.76±1.78μg/ml和18.22±1.64μg/ml,48h和72hIC50值比較無統(tǒng)計學(xué)意義;
　　 ③0μg/ml-80μg/ml白藜蘆醇作用HepG2細(xì)胞的抑制率＜0.3，藥敏陰性，白藜蘆醇對LO2細(xì)胞的生長抑制作用不明顯。
　　 (2)檢測各組細(xì)胞的增殖能力和凋亡情況:
　　 ①顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)改變:白藜蘆醇和5-F

6、U作用48h后，HepG2細(xì)胞開始明顯變化，皺折，細(xì)胞邊界不清楚，折光性差，細(xì)胞漂浮;而HepG2細(xì)胞陰性對照組、白藜蘆醇作用LO2細(xì)胞48h后，表現(xiàn)為細(xì)胞邊緣光滑清晰、細(xì)胞減少不明顯;
　　 ②MTT法:LO2細(xì)胞白藜蘆醇組、HepG2細(xì)胞白藜蘆醇組、HepG2細(xì)胞5-FU組的抑制率為9.0％、49.3％、54.7％，HepG2細(xì)胞白藜蘆醇組、HepG2細(xì)胞5-FU組的細(xì)胞抑制率分別和HepG2細(xì)胞陰性對照組、及LO2細(xì)胞白藜

7、蘆醇組進(jìn)行比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)，前兩組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)，后兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 ③Annexin V-FITC雙標(biāo)法檢測凋亡比例:HepG2細(xì)胞陰性對照組、LO2細(xì)胞白藜蘆醇組、HepG2細(xì)胞白藜蘆醇組、HepG2細(xì)胞5-FU組的細(xì)胞凋亡率分別為3.79％、4.62％、21.15％、24.95％，HepG2細(xì)胞白藜蘆醇組、HepG2細(xì)胞5-FU組的細(xì)胞抑制率分別和HepG2細(xì)胞

8、陰性對照組、及LO2細(xì)胞白藜蘆醇組進(jìn)行比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)，前兩組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)，后兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論:(1)白藜蘆醇對人肝癌細(xì)胞HepG2起增殖抑制和促進(jìn)凋亡作用，成時間-濃度依賴性;(2)白藜蘆醇對LO2細(xì)胞的增殖無明顯影響。
　　 第二章白藜蘆醇對HepG2細(xì)胞作用機制的探討
　　 目的:檢測MnSOD、SIRT3、P53、Bax、Fas在白藜蘆

9、醇作用下HepG2細(xì)胞中的表達(dá)。
　　 方法:通過CuZn/Mn-SOD活性檢測試劑盒(WST)法檢測HepG2細(xì)胞中MnSOD酶活力的改變。通過RT-PCR、Western-blot檢測SIRT3、P53、Bax、Fas在白藜蘆醇作用下HepG2細(xì)胞中的表達(dá)。
　　 結(jié)果:WST法結(jié)果顯示，白藜蘆醇作用HepG2細(xì)胞48h后，MnSOD酶活性增強，RT-PCR實驗結(jié)果顯示，白藜蘆醇作用HepG2細(xì)胞48h后，SIRT3

10、、Fas、Bax和p53 mRNA在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)增高(p＜0.01)。Western-blot實驗結(jié)果顯示，白藜蘆醇作用HepG2細(xì)胞48h后，SIRT3、Fas、Bax和p53蛋白在HepG2細(xì)胞中的蛋白表達(dá)增高(p＜0.01)。
　　 結(jié)論:白藜蘆醇能使SIRT3在HepG2細(xì)胞中高表達(dá)，從而上調(diào)MnSOD及p53表達(dá)水平，進(jìn)而上調(diào)Bax、Fas來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　 總結(jié)論:
　　 (1)白藜蘆醇