阻斷Hedgehog信號通路對人食管癌EC109細胞轉(zhuǎn)移的影響及可能機制.pdf

1、研究背景:目前食管癌(Esophageal cancer)是全世界最常見的惡性腫瘤之一，在我國尤為突出，是發(fā)病率最高的國家。食管癌惡性程度高，且大部分患者得到臨床確診后已屬晚期，預后極差，對于早期患者手術盡管是目前治療的首先方式，但手術后容易復發(fā)及轉(zhuǎn)移。癌細胞早期容易侵襲轉(zhuǎn)移是其主要原因，另外，術后缺乏敏感的抑制腫瘤細胞的藥物，常用的化療藥物靶向效應不強，副反應較重等也是食管癌患者生存率較低的重要原因之一。Hedgehog(Hh)信號通

2、路由Hh-Ptch-Smo-Gli級聯(lián)構成，當Hh蛋白配體與膜受體Ptch結合時，可以消除膜受體Ptch對Smo的抑制效應， Smo的激活又可進一步激活核轉(zhuǎn)錄因子Gli，從而誘導下游目標基因的表達。近年研究顯示Hh信號通路與人類乳腺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌等多種腫瘤的發(fā)病及轉(zhuǎn)移密切相關，食管癌的Hh通路高度激活也已得到證實，但Hh通路與食管癌細胞轉(zhuǎn)移能力的關系卻缺乏深入的研究。已證實血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)及基質(zhì)金屬蛋白酶-9(M

3、MP-9)與食管癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移密切相關，也有研究表明二者與Hh通路有密切聯(lián)系，但具體作用機制的研究仍處于初級階段。
　　 目的:本實驗以食管癌EC109細胞系為研究對象，利用Hh信號通路特異性阻滯劑環(huán)巴胺（Cyclopamine）處理EC109細胞，然后觀察細胞轉(zhuǎn)移能力的變化及轉(zhuǎn)移相關因子MMP-9、VEGF蛋白表達水平的影響，并分析其可能的機制，為臨床食管癌靶向藥物的研究提供理論與實驗依據(jù)。
　　 方法:

4、　　 1.培養(yǎng)EC109細胞為實驗對象，用Hh信號通路特異性阻滯劑環(huán)巴胺(Cyclopamine)作用EC109細胞后，MTT法觀察環(huán)巴胺對EC109細胞的抑制作用，并計算出相應的半數(shù)抑制率(IC50)。
　　 2.Transwell小室法觀察經(jīng)環(huán)巴胺處理后EC109細胞的遷移、侵襲能力的變化。
　　 3.體外血管生成實驗觀察環(huán)巴胺對EC109細胞在體外血管形成能力的影響。
　　 4.RT-PCR方法檢測食管癌

5、細胞經(jīng)環(huán)巴胺處理后的Gli-1mRNA表達變化。
　　 5.Western blot方法檢測食管癌細胞經(jīng)環(huán)巴胺處理后Gli-1、MMP-9、VEGF蛋白的表達變化。
　　 結果:
　　 1.環(huán)巴胺處理EC109細胞后可以抑制其增殖及生長，細胞由飽滿的梭形貼壁生長狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)檩喞磺宓膱A鈍半貼壁狀態(tài)，在一定濃度下抑制率隨濃度增高而增大且具有相關性，且干預的時間越長，其抑制率也隨之加大，在相當?shù)姆秶鷥?nèi)具有藥物作用時間和

6、作用濃度依賴性。作用2天后的IC50為12μmol/L。
　　 2.在Transwell小室實驗中我們發(fā)現(xiàn)，環(huán)巴胺阻斷Hh信號通路后，與對照組相比，食管癌細胞的體外遷移、侵襲及血管形成能力顯著下降，遷移出小室微孔膜的細胞數(shù)明顯減少(32.80±6.77) vs(98.40±10.08)，侵襲穿膜細胞數(shù)也明顯減少(26.20±4.58) vs(83.40±8.65);血管形成數(shù)減少(8.60±2.70) vs(19.40±4.86

7、)。
　　 3.以RT-PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)，環(huán)巴胺干預后的食管癌細胞Gli-lmRNA表達較對照組明顯下降(2.89±0.34) vs(5.58±0.89))。
　　 4.通過Western blot方法對蛋白水平的檢測發(fā)現(xiàn)，實驗組與對照組相比， Gli-1、MMP-9和VEGF蛋白的相對表達量都下降。
　　 結論:EC109細胞中具有激活狀態(tài)的Hh信號通路，且能被環(huán)巴胺阻斷，阻斷Hh信號通路后能顯著抑制EC10