阻斷Hedgehog信號(hào)通路對(duì)人食管癌EC109細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響及可能機(jī)制.pdf

1、研究背景:目前食管癌(Esophageal cancer)是全世界最常見的惡性腫瘤之一，在我國(guó)尤為突出，是發(fā)病率最高的國(guó)家。食管癌惡性程度高，且大部分患者得到臨床確診后已屬晚期，預(yù)后極差，對(duì)于早期患者手術(shù)盡管是目前治療的首先方式，但手術(shù)后容易復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。癌細(xì)胞早期容易侵襲轉(zhuǎn)移是其主要原因，另外，術(shù)后缺乏敏感的抑制腫瘤細(xì)胞的藥物，常用的化療藥物靶向效應(yīng)不強(qiáng)，副反應(yīng)較重等也是食管癌患者生存率較低的重要原因之一。Hedgehog(Hh)信號(hào)通

2、路由Hh-Ptch-Smo-Gli級(jí)聯(lián)構(gòu)成，當(dāng)Hh蛋白配體與膜受體Ptch結(jié)合時(shí)，可以消除膜受體Ptch對(duì)Smo的抑制效應(yīng)， Smo的激活又可進(jìn)一步激活核轉(zhuǎn)錄因子Gli，從而誘導(dǎo)下游目標(biāo)基因的表達(dá)。近年研究顯示Hh信號(hào)通路與人類乳腺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌等多種腫瘤的發(fā)病及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，食管癌的Hh通路高度激活也已得到證實(shí)，但Hh通路與食管癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的關(guān)系卻缺乏深入的研究。已證實(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)及基質(zhì)金屬蛋白酶-9(M

3、MP-9)與食管癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，也有研究表明二者與Hh通路有密切聯(lián)系，但具體作用機(jī)制的研究仍處于初級(jí)階段。
　　 目的:本實(shí)驗(yàn)以食管癌EC109細(xì)胞系為研究對(duì)象，利用Hh信號(hào)通路特異性阻滯劑環(huán)巴胺（Cyclopamine）處理EC109細(xì)胞，然后觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的變化及轉(zhuǎn)移相關(guān)因子MMP-9、VEGF蛋白表達(dá)水平的影響，并分析其可能的機(jī)制，為臨床食管癌靶向藥物的研究提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:

4、　　 1.培養(yǎng)EC109細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，用Hh信號(hào)通路特異性阻滯劑環(huán)巴胺(Cyclopamine)作用EC109細(xì)胞后，MTT法觀察環(huán)巴胺對(duì)EC109細(xì)胞的抑制作用，并計(jì)算出相應(yīng)的半數(shù)抑制率(IC50)。
　　 2.Transwell小室法觀察經(jīng)環(huán)巴胺處理后EC109細(xì)胞的遷移、侵襲能力的變化。
　　 3.體外血管生成實(shí)驗(yàn)觀察環(huán)巴胺對(duì)EC109細(xì)胞在體外血管形成能力的影響。
　　 4.RT-PCR方法檢測(cè)食管癌

5、細(xì)胞經(jīng)環(huán)巴胺處理后的Gli-1mRNA表達(dá)變化。
　　 5.Western blot方法檢測(cè)食管癌細(xì)胞經(jīng)環(huán)巴胺處理后Gli-1、MMP-9、VEGF蛋白的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.環(huán)巴胺處理EC109細(xì)胞后可以抑制其增殖及生長(zhǎng)，細(xì)胞由飽滿的梭形貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)檩喞磺宓膱A鈍半貼壁狀態(tài)，在一定濃度下抑制率隨濃度增高而增大且具有相關(guān)性，且干預(yù)的時(shí)間越長(zhǎng)，其抑制率也隨之加大，在相當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)具有藥物作用時(shí)間和

6、作用濃度依賴性。作用2天后的IC50為12μmol/L。
　　 2.在Transwell小室實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，環(huán)巴胺阻斷Hh信號(hào)通路后，與對(duì)照組相比，食管癌細(xì)胞的體外遷移、侵襲及血管形成能力顯著下降，遷移出小室微孔膜的細(xì)胞數(shù)明顯減少(32.80±6.77) vs(98.40±10.08)，侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)也明顯減少(26.20±4.58) vs(83.40±8.65);血管形成數(shù)減少(8.60±2.70) vs(19.40±4.86

7、)。
　　 3.以RT-PCR方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，環(huán)巴胺干預(yù)后的食管癌細(xì)胞Gli-lmRNA表達(dá)較對(duì)照組明顯下降(2.89±0.34) vs(5.58±0.89))。
　　 4.通過Western blot方法對(duì)蛋白水平的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比， Gli-1、MMP-9和VEGF蛋白的相對(duì)表達(dá)量都下降。
　　 結(jié)論:EC109細(xì)胞中具有激活狀態(tài)的Hh信號(hào)通路，且能被環(huán)巴胺阻斷，阻斷Hh信號(hào)通路后能顯著抑制EC10