白藜蘆醇對(duì)小鼠腎臟衰老的影響

1、<p>　　白藜蘆醇對(duì)小鼠腎臟衰老的影響</p><p>　　學(xué) 生：李忠持</p><p>　　指導(dǎo)老師：王 釗 易宗春</p><p><b>　　摘 要</b></p><p>　　衰老是人類不可避免的復(fù)雜生理現(xiàn)象，而腎臟是伴隨著衰老而出現(xiàn)明顯形態(tài)和功能改變的重要器官之一。有研究發(fā)現(xiàn)，長期

2、高脂飲食習(xí)慣會(huì)嚴(yán)重影響大鼠的認(rèn)知能力，使機(jī)體出現(xiàn)提前衰老的癥狀[1]。白藜蘆醇是一種生物性很強(qiáng)的天然多酚類物質(zhì)，它不僅是植物遭受脅迫時(shí)產(chǎn)生的一種能提高植物抵抗病原性攻擊和環(huán)境惡化的植物抗毒素, 還具有抗癌[2]、抗氧化[3]、調(diào)節(jié)血脂[4]、影響壽命[5]等多方面有益于人類健康的重要功能。沉默信息調(diào)節(jié)因子-2家族在很多種模式生物中已經(jīng)成為一類對(duì)于衰老起著關(guān)鍵作用的調(diào)控因子，它們具有高度保守的酶催化核心結(jié)構(gòu)區(qū)域。哺乳動(dòng)物Sirtuins家

3、族由7個(gè)成員組成， 其中SIRT1被多次認(rèn)定為長壽基因[6]。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)SIRT6作為哺乳動(dòng)物中NAD+依賴的組蛋白去乙?；福瑢?duì)機(jī)體壽命調(diào)控有重要作用[7]。研究發(fā)現(xiàn)：白藜蘆醇等植物中多酚類小分子主要是通過激活組蛋白去乙酰化酶的活性，進(jìn)而調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄及活性來實(shí)現(xiàn)的[8]。</p><p>　　本試驗(yàn)中使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是經(jīng)過高脂飲食、高脂飲食加白藜蘆醇、正常飲食、正常飲食加白藜蘆醇四種培養(yǎng)方式培

4、養(yǎng)三個(gè)月后獲得的，提取腎臟組織后分別進(jìn)行PAS、HE、Masson、β-gal染色。提取組織蛋白和RNA，通過western blot來檢測(cè)SIRT6的表達(dá)量以及NF-κB的乙酰化水平，通過Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)SIRT6的RNA表達(dá)水平。研究結(jié)果：從四種染色結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對(duì)高脂飲食引起的腎臟早老具有改善作用，但對(duì)于正常飲食的小鼠腎臟無明顯作用；進(jìn)行高脂飲食處理的小鼠腎臟SIRT6表達(dá)量最低，乙?；腘F-κB表達(dá)量最

5、高，經(jīng)過白藜蘆醇作用后，SIRT6表達(dá)量升高，乙?；腘F-κB表達(dá)量下降；對(duì)于正常飲食的小鼠是否加入白藜蘆醇對(duì)SIRT6和乙?；腘F-κB表達(dá)量的影響不大。從而得出，白藜蘆醇確實(shí)可以改善由高脂飲食引起的腎臟衰老，而且可能是通過調(diào)節(jié)NF-κB的乙酰化水平來實(shí)現(xiàn)的，但對(duì)于正常飲食的小鼠，白藜蘆醇沒有明顯的改善作用。</p><p>　　關(guān)鍵詞：腎臟衰老，白藜蘆醇，高脂飲食，SIRT6，NF-κB</p>

6、;<p>　　Effects of resveratrol on aging kidney of mice induced by high-fat diet </p><p>　　Author: LI Zhong-chi</p><p>　　Tutor: WANG Zhao</p><p>　　YI Zong-chun</p><p

7、><b>　　Abstract </b></p><p>　　Aging is an inevitable physiological phenomenon full of complexity, and the kidney is one of the most vital organs accompanied by significant morphological and fun

8、ctional changes. From the study of model animals, we have confirmed that high-fat diet is the key cause of cardiovascular disease. Long-term high-fat diet would adversely affect cognitive abilities in rats, so that the b

9、ody appears premature aging symptoms [1]. Resveratrol is a natural polyphenol with strong Biological activity. It is </p><p>　　The experimental animals used in this experiment is fed through high-fat diet, h

10、igh-fat diet plus resveratrol, a normal diet and normal diet plus resveratrol four means, and we get their kidneys after three months. After that we test the kidney tissues though PAS, HE, Masson, β-gal staining. We extr

11、act the tissue total proteins and total RNA, detecting the expression levels of SIRT6 and acetylation of NF-κB by western blot and Real-time PCR. Results: from the four ways of staining, we find that </p><p>

12、;　　Key Words: aging kidney, resveratrol, high-fat diet, SIRT6, NF-κB</p><p><b>　　目 錄</b></p><p><b>　　1 緒論1</b></p><p>　　1.1課題背景及目的1</p><

13、;p>　　1.2國內(nèi)外研究狀況3</p><p>　　1.3論文構(gòu)成及研究內(nèi)容10</p><p>　　2 研究方案12</p><p>　　2.1研究目標(biāo)12</p><p>　　2.2儀器設(shè)備、材料、試劑藥品的選擇12</p><p>　　2.3實(shí)驗(yàn)內(nèi)容13</p>&l

14、t;p>　　3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果18</p><p>　　3.1PAS染色結(jié)果18</p><p>　　3.2HE染色結(jié)果19</p><p>　　3.3Masson染色結(jié)果21</p><p>　　3.4SA-β-gal 染色結(jié)果22</p><p>　　3.5Western-blot 結(jié)果24

15、</p><p>　　3.6Real-time PCR 結(jié)果25</p><p>　　4 討論與展望26</p><p>　　4.1高脂飲食誘導(dǎo)腎臟衰老26</p><p>　　4.2白藜蘆醇對(duì)高脂飲食引起的腎臟衰老有緩解作用27</p><p>　　4.3SITR6在白藜蘆醇緩解衰老過程中發(fā)揮作用

16、28</p><p><b>　　4.4展望28</b></p><p><b>　　結(jié)論31</b></p><p><b>　　致謝32</b></p><p><b>　　參考文獻(xiàn)33</b></p><p>　　附

17、錄A BCA 法測(cè)蛋白質(zhì)濃度35</p><p>　　附錄B western blot 操作方法36</p><p>　　附錄C Real-time PCR 操作流程39</p><p><b>　　1 緒論</b></p><p><b>　　課題背景及目的</b></p>

18、;<p>　　2011年進(jìn)行了我國第六次人口普查，結(jié)果顯示，中國人口的老齡化加速，65歲及以上人口的比例上升了1.91個(gè)百分點(diǎn)，國家即將面臨非常嚴(yán)重的老齡化問題。因此，有關(guān)老齡化和衰老的研究已經(jīng)是刻不容緩。隨著社會(huì)的不斷進(jìn)步，人民的生活水平不斷提高，人們對(duì)于健康的要求也越累越高，于是在世界范圍內(nèi)的衰老研究，正在火熱進(jìn)行中。</p><p>　　對(duì)于衰老的定義，多年來眾說紛紜，基本上可以總結(jié)為人體各個(gè)

19、組織和器官在各種內(nèi)、外環(huán)境的長期作用下，各器官功能逐漸減退的過程。其中，腎臟的衰老對(duì)機(jī)體的影響尤其重要。在腎臟的衰老過程中，一般都會(huì)出現(xiàn)形態(tài)、結(jié)構(gòu)以及功能上的變化，這在臨床上的表現(xiàn)可能為腎功能的減退，腎儲(chǔ)備能力的下降以及對(duì)應(yīng)激耐受的能力降低等。人們的兩個(gè)腎在40歲左右便開始出現(xiàn)體積的縮小和重量的減輕，在75歲左右時(shí)，腎臟的重量下降約30%，體積也會(huì)下降20％，造成這個(gè)結(jié)果的原因是隨著年齡的增加，結(jié)構(gòu)正常的腎小管和腎小球的數(shù)量會(huì)發(fā)生進(jìn)行性

20、的減少，他們的功能也會(huì)發(fā)生進(jìn)行性的減退[9]。腎小管萎縮，腎小球硬化及腎間質(zhì)的纖維化通常是老年人腎臟的主要病理改變。有研究顯示：健康的成年人在30歲后就可能出現(xiàn)腎小球硬化，但比例一般不超過3％，60歲～69歲可增高到l0％，70歲～79歲時(shí)甚至高達(dá)l9％，高于80歲的老年人約25％的腎小球完全硬化。由于硬化的腎小球逐漸增多，這會(huì)直接影響腎小球?yàn)V過率(GFR)，有研究證實(shí)，40歲以后，腎小球的濾過率在每l0年可減少8～10 ml／min[

21、10]。隨著年齡增長，硬化腎小球數(shù)目增多的機(jī)制還不明確，但血管的</p><p>　　第一次把生物壽命和能量代謝聯(lián)系在一起的是近100年前的德國生理學(xué)家Rubner[9]。他檢測(cè)了5 種哺乳動(dòng)物的能量代謝輸出，發(fā)現(xiàn)不同物種的壽命限制存在顯著差異，但不同物種代謝率（即單位體質(zhì)能量代謝）以及生命過程中的能量輸出差別不大。1928 年這個(gè)觀點(diǎn)被提出，在整個(gè)生命過程中，物種的代謝率和它的壽命是呈負(fù)相關(guān)的，生命能夠持續(xù)下去

22、是與能量消耗密切相關(guān)的，如果代謝率越高，能量消耗越高，那么衰老的速度就越快，壽命就會(huì)越短。</p><p>　　在模式生物以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究中證實(shí)，高脂飲食是引起心腦血管疾病的關(guān)鍵原因，長期高脂飲食患有過度肥胖甚至二型糖尿病的概率也有相當(dāng)程度的提高。有研究發(fā)現(xiàn)，長期高脂飲食習(xí)慣會(huì)嚴(yán)重影響大鼠的認(rèn)知能力，進(jìn)而使機(jī)體出現(xiàn)提前衰老的癥狀[1]。這個(gè)現(xiàn)象也會(huì)出現(xiàn)在人類的身上，對(duì)于這個(gè)問題，除了控制飲食能有效避免提前衰老之

23、外，找到有效的藥物來緩解高脂飲食帶來的危害也成為了另外一條途徑。</p><p>　　白藜蘆醇(Resveratrol)是含有芪類結(jié)構(gòu)的非黃酮類多酚化合物。它廣泛的存在于葡萄、虎杖、松樹、決明子和花生等天然植物中，到目前為止，至少已經(jīng)在21科、31屬的72 種植物中發(fā)現(xiàn)有白藜蘆醇。它是許多植物受到各種脅迫(如真菌感染、紫外照射等)時(shí)產(chǎn)生的一種植物抗毒素。白藜蘆醇不僅能使植物的生存能力提高，研究發(fā)現(xiàn)它還具有許多對(duì)人

24、類健康有益的生物學(xué)活性以及藥理作用，這也使它多年來被廣泛重視，對(duì)于白藜蘆醇的研究也日益增多。白藜蘆醇的化學(xué)名稱為3, 5, 4’-三羥基二苯乙烯，分子式為C14H12O3，分子量為228.25 kd,是無色針狀晶體，難溶于水，易溶于乙醇、乙酸乙酯、丙酮等極性溶劑[2]。目前能夠在市場(chǎng)上買到的白藜蘆醇大部分還是通過植物提取技術(shù)獲得的，但是這種方法的成本非常高，最后的產(chǎn)率也不高，關(guān)鍵是植物資源也是有限的。近年來，白藜蘆醇在心血管和腫瘤等疾病

25、中的作用越來越受到人們的重視，國內(nèi)外對(duì)白藜蘆醇的合成研究有了很大進(jìn)展。目前已經(jīng)可以成熟應(yīng)用五種化學(xué)合成的方法來合成白藜蘆醇。隨著人們生活水平的提高，人們對(duì)食品營養(yǎng)及醫(yī)療保健需要也有了提升，通過基因工程的手段來提高植物中白藜蘆醇含量</p><p>　　沉默信息調(diào)節(jié)因子2（Silent mating type information regulation 2, Sir2）家族作為一類對(duì)衰老起著至關(guān)重要的調(diào)控因子在許

26、多生物中發(fā)揮著巨大的作用，從噬菌體到人類以及各種生物體中，Sir2蛋白都是非常保守。這些不同生物體中的Sir2蛋白極其同源類似物被稱作“Sirtuins”，它們的酶催化核心結(jié)構(gòu)區(qū)域高度保守[6]。哺乳動(dòng)物的Sirtuins家族由7個(gè)成員組成，即SIRTt1~SIRT7。其中，SIRT1被多次認(rèn)定為長壽基因。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1可以通過一個(gè)潛在的機(jī)制增加壽命，延緩衰老，而且這個(gè)過程是與熱量限制密切相關(guān)的。哺乳動(dòng)物中SIRT6作為NAD+

27、依賴的組蛋白去乙?；福跈C(jī)體壽命的調(diào)控過程中發(fā)揮了重要作用，它們主要表現(xiàn)在：(1) 調(diào)控炎癥反應(yīng)；(2) 維持基因組和端粒穩(wěn)定；(3) 調(diào)節(jié)糖和脂肪的能量代謝 [7]。對(duì)于SIRT1在衰老過程中的作用的相關(guān)研究已經(jīng)持續(xù)了很長時(shí)間，一直是科學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn)，但幾年前新研究發(fā)現(xiàn)SIRT6在衰老過程中也發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，也多次被證明能夠調(diào)控衰老，但在器官層面的研究并不多。</p><p>　　核轉(zhuǎn)錄因子N

28、F-κB是在炎癥，衰老和凋亡中發(fā)揮重要功能的轉(zhuǎn)錄因子，而且在衰老的組織器官中，NF-κB被激活的強(qiáng)度增高。在某些應(yīng)激條件下，與NF-κB結(jié)合的抑制子IKK(inhibitor of nuclear factor κB kinase)會(huì)發(fā)生解離，IKK經(jīng)泛素化降解, NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，誘導(dǎo)下游靶基因的表達(dá)。已有研究證明SIRT6與NF-κB有相互作用[11]。</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)將三月齡的小鼠采用四種不

29、同培養(yǎng)方式來飼養(yǎng)，分別為高脂飲食、高脂飲食加白藜蘆醇、正常飲食、正常飲食加白藜蘆醇，培養(yǎng)三個(gè)月后，取出各個(gè)小鼠的腎臟組織，一部分用于切片包埋，分別進(jìn)行HE、Masson、PAS、β-gal染色，來判斷不同腎臟組織的衰老情況，此外提取腎臟組織的總蛋白和RNA，檢測(cè)SIRT6和乙?；疦F-κB蛋白的表達(dá)量，以及SIRT6的RNA水平，從分子角度檢測(cè)腎臟衰老情況，并嘗試對(duì)結(jié)果做出解釋。最后綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，判斷白藜蘆醇對(duì)于高脂飲食帶來的后果是否有

30、改善作用，而對(duì)于正常飲食的小鼠，白藜蘆醇能否會(huì)進(jìn)一步提高健康程度，進(jìn)而為腎臟衰老研究奠定基礎(chǔ)。</p><p><b>　　國內(nèi)外研究狀況</b></p><p>　　1.2.1腎臟衰老的表現(xiàn)、機(jī)制以及對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的影響</p><p>　　研究發(fā)現(xiàn)，腎臟體積在人40歲左右時(shí)達(dá)到最大，質(zhì)量約為400g，長度約為12cm，40歲以后，腎臟的體積會(huì)每

31、10年以大約10%的速度遞減，男性與女性相比更加明顯[10]。在功能上主要表現(xiàn)為腎小球的濾過濾和腎血流量的下降。有研究發(fā)現(xiàn)，與青年組相比，老年組患者濾過膜面積、單個(gè)腎小球超濾系數(shù)、以及腎小球的體積都明顯增大，而濾過膜的有效通透系數(shù)沒有發(fā)生明顯改變，這個(gè)現(xiàn)象提示老年人的腎臟存在腎小球代償性肥大。因此，作者推測(cè)可能是因?yàn)樵谒ダ线^程中，腎單位出現(xiàn)了功能受損和數(shù)量減少，為了維持正常的腎功能，殘余腎單位才會(huì)出現(xiàn)代償性肥大，但是經(jīng)過長期高灌注、高濾

32、過等類似因素的作用下，原本肥大的腎小球發(fā)生了萎縮硬化。在不可逆的腎損傷中，腎小球硬化是發(fā)生率極高的一種，隨著年齡的增加，其硬化率在成年以后逐漸增高，并與高血壓等因素的影響無關(guān)[12]。</p><p>　　腎小球功能的下降主要明顯體現(xiàn)在腎血流量的下降和腎小球?yàn)V過率的下降。然而，盡管對(duì)于同一個(gè)腎臟，腎血流量在不同部位的下降速度也是不同的，這個(gè)現(xiàn)象是與皮質(zhì)腎單位的丟失和腎皮質(zhì)血液異常分流至腎髓質(zhì)有很大的關(guān)系。目前研究

33、已經(jīng)明確，在不同性別個(gè)體中腎血流量的變化也會(huì)有區(qū)別，而且這個(gè)變化還會(huì)受到疾病和高血壓的影響，相比之下，男性比女性的腎血流量下降幅度更明顯，高血壓患者比血壓正常的個(gè)體腎血流量下降幅度更大[9]。在衰老過程中，與腎臟有關(guān)的內(nèi)分泌系統(tǒng)功能的改變和腎臟自身調(diào)節(jié)能力的改變也是導(dǎo)致慢性腎損傷的因素，當(dāng)腎素血管緊張素系統(tǒng)及一氧化氮系統(tǒng)的功能出現(xiàn)異常，或腎血管對(duì)舒血管物質(zhì)的反應(yīng)性減弱，或?qū)Υ龠M(jìn)血管收縮的物質(zhì)反應(yīng)性增強(qiáng)時(shí)，腎血流量將會(huì)明顯下降，并導(dǎo)致諸如

34、血壓正常缺血性腎病患者腎組織病理性變化[13]。</p><p>　　研究發(fā)現(xiàn)在腎臟衰老過程中，線粒體等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)也會(huì)出現(xiàn)衰老的改變，而且這個(gè)過程還常伴有脂褐素的沉積。脂褐素，也叫做老年素，是黃褐色的不規(guī)則小體，在衰老過程中可以在神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肝臟細(xì)胞等組織細(xì)胞中發(fā)生沉積。這里提到的脂褐素與普通的脂褐素不同，溶酶體也無法降解，這些脂褐素大量蓄積后會(huì)導(dǎo)致溶酶體崩解破裂，進(jìn)而釋放出各種酶，這就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功

35、能發(fā)生損傷。眾所周知，腎小球的足細(xì)胞的靶點(diǎn)可以是身體中的代謝產(chǎn)物、免疫及氧化應(yīng)激等等因素，然而足細(xì)胞自身修復(fù)能力有限。最近的研究發(fā)現(xiàn)，自體吞噬作用是細(xì)胞提高對(duì)損傷的應(yīng)激能力和自身修復(fù)能力的有效方式。在最初的時(shí)候，人們認(rèn)為自體吞噬作用只是細(xì)胞對(duì)半衰期比較長的細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)以及功能受損的細(xì)胞器的非選擇性降解作用，是細(xì)胞的天然防御方式。如今我們已經(jīng)明確，自體吞噬作用主要是通過將細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器及蛋白質(zhì)降解，從而能夠平衡細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和疾病的發(fā)生。將

36、與自體吞噬有關(guān)的基因特異性敲除后，腎小球的足細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)蛋白質(zhì)和線粒體的蓄積以及功能異常或缺失的現(xiàn)象，這就大大影響了足細(xì)胞正常功能。然而，這些在衰老細(xì)胞中也會(huì)發(fā)生類似的改變，從而說明了自體吞噬系統(tǒng)很可能參與細(xì)胞衰老的</p><p>　　曾經(jīng)有報(bào)道提出基因的異常表達(dá)可能是引起衰老原因。通過基因芯片技術(shù)，人們篩選出了腎臟衰老相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)、蛋白質(zhì)合成相關(guān)基因、能量代謝相關(guān)基因細(xì)胞周期——有絲分裂相關(guān)基因及DNA-RN

37、A損傷修復(fù)相關(guān)基因等在衰老腎組織中的轉(zhuǎn)錄水平顯著下降，而應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)、腫瘤相關(guān)基因、炎性反應(yīng)相關(guān)基因、細(xì)胞外基質(zhì)代謝-細(xì)胞骨架相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生明顯上調(diào)。此外，在衰老的腎組織中，尤其是富含線粒體的近曲小管中，可以發(fā)現(xiàn)DNA突變?cè)龆?。Klotho基因是一種衰老抑制基因，當(dāng)其在體內(nèi)過度表達(dá)時(shí)，可延緩衰老過程，如果通過干擾大鼠這個(gè)基因表達(dá)缺陷，則可加速其器官衰老[15]。 </p><p>　　在衰老個(gè)體中，腎臟細(xì)胞對(duì)

38、有毒物質(zhì)的處理能力以及體內(nèi)外各種刺激的反應(yīng)性明顯下降，細(xì)胞更容易感受凋亡的刺激。自由基在細(xì)胞內(nèi)大量蓄積，多是由于在有氧代謝、感染、損傷以及炎癥反應(yīng)過程中產(chǎn)生的自由基水平與機(jī)體自身產(chǎn)生的自由基清除劑（如超氧化物歧化酶、維生素C、E及硒等）清除氧自由基作用的失衡導(dǎo)致的，這就引起了細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的嚴(yán)重受損，進(jìn)而發(fā)生細(xì)胞凋亡。當(dāng)然，組織缺氧、組織纖維化及炎性反應(yīng)相關(guān)分子的產(chǎn)生和衰老細(xì)胞分泌生長因子水平的變化，這幾個(gè)因素也可能與腎臟的損傷

39、及修復(fù)能力下降有關(guān)。</p><p>　　目前的研究報(bào)道提及了許多關(guān)于衰老的機(jī)制，但是沒有任何一個(gè)確定的機(jī)制，而且多數(shù)研究還只是集中于某一個(gè)機(jī)制上。隨著衰老過程的延續(xù)，腎臟的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、腎小球形態(tài)及功能，以及腎小囊等結(jié)構(gòu)都會(huì)發(fā)生明顯的變化，盡管在衰老的個(gè)體中都會(huì)發(fā)生，但不同的飲食習(xí)慣，以及各種疾病如高血壓、糖尿病等疾病，還有其他因素如吸煙、肥胖、藥物濫用的影響，都會(huì)是使衰老在個(gè)體之間表現(xiàn)出差異性。</p>

40、;<p>　　1.2.2 白藜蘆醇有效延緩機(jī)體衰老</p><p>　　白藜蘆醇是一種非黃酮類多酚化合物，它含有芪類結(jié)構(gòu)。它不僅是植物遭受脅迫時(shí)產(chǎn)生的一種能提高植物抵抗環(huán)境惡化和病原性攻擊的植物抗毒素，還具有調(diào)節(jié)血脂、抗氧化、抗癌、影響壽命等多方面對(duì)人類健康有益的重要功能[2]。目前已經(jīng)有多種化學(xué)和生物的方法來制備。</p><p>　　作為植物的代謝產(chǎn)物，白藜蘆醇的多種生物

41、學(xué)功能都深深地吸引著人們，也被多次證明了具有明顯的保健作用。隨著對(duì)其越來越多的功能研究，人們對(duì)其發(fā)揮功能的分子機(jī)制也有了初步了解。有研究發(fā)現(xiàn)：不僅白藜蘆醇有這樣的保健效果，在植物中還存在著多種多酚類小分子物質(zhì)，如漆樹黃酮、紫鉚因等都具有較強(qiáng)的抗氧化、抗自由基作用，它們發(fā)揮功能主要是通過激活組蛋白去乙?；傅幕钚裕瑥亩{(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄及活性來實(shí)現(xiàn)的。SIRT1是Sirtuins 家族成員之一，是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)

42、的組蛋白去乙酰酶，可以調(diào)控許多轉(zhuǎn)錄因子，如抑癌基因(Tumour suppressor gene, p53)、叉頭轉(zhuǎn)錄因子(Forkhead box class O, FOXO)等。作為底物，具有調(diào)控基因沉默、調(diào)節(jié)代謝過程、影響壽命長短等功能。哺乳動(dòng)物中SIRT1 與酵母染色質(zhì)沉默因子Sir2(Slient information regulator 2)同源，主要通過與一些相關(guān)的細(xì)胞因子相互作用來發(fā)揮其功能[16]。白藜蘆醇可以激活S

43、IRT1的活性，進(jìn)而調(diào)控一系列反應(yīng)。</p><p>　　在白藜蘆醇的多種藥理作用中，抗癌、抗腫瘤的作用是最受人們關(guān)注的。癌癥一般具有3個(gè)階段（起始、增殖、發(fā)生），在進(jìn)一步的研究中發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇對(duì)這3 個(gè)階段都有明顯的抑制作用，甚至?xí)l(fā)生逆轉(zhuǎn)。近幾年研究表明：白藜蘆醇可以通過抑制由MAPK或NF-κB途徑調(diào)節(jié)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來促進(jìn)癌細(xì)胞的自溶[2]。</p><p>　　白藜蘆醇可以通過減少

44、舒張血管、心肌缺血、抗動(dòng)脈粥樣硬化、再灌注損傷等現(xiàn)象發(fā)揮保護(hù)心血管的作用。濃度為0.1μmol/L的白藜蘆醇可以使血管舒張，進(jìn)而可以降低血壓和降低患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)。在中國的民間，早就有用富含白藜蘆醇的中藥來治療和預(yù)防一些心血管疾病的記錄。最近也有研究表明，白藜蘆醇是一種有效的預(yù)防心臟功能紊亂的天然分子[4]。</p><p>　　隨著對(duì)白藜蘆醇報(bào)道的增多，也逐漸引起了人們對(duì)其他多酚類物質(zhì)的關(guān)注，近年來發(fā)現(xiàn)多酚類

45、物質(zhì)大多都含有顯著的抗氧化、抗自由基的作用。有研究報(bào)道稱，當(dāng)將白藜蘆醇的濃度控制在1.3 μg/mL時(shí)，能明顯抑制在大鼠紅細(xì)胞中由過氧化氫引起的氧化溶血和自氧化溶血，并且對(duì)小鼠體內(nèi)過個(gè)器官的過氧化脂質(zhì)的產(chǎn)生有明顯的抑制作用。 多酚類物質(zhì)能夠顯著增加LDL(Low-density lipoproteins, LDL)的抗氧化活性，其中白藜蘆醇的活性最強(qiáng)。研究表明，對(duì)于防治衰老相關(guān)的氧化脅迫，白藜蘆醇具有良好的作用。由于白藜蘆醇有抗氧化作用

46、, 它可能通過調(diào)節(jié)乙酰膽堿酯酶來改善AD(Alzheimer’s disease)小鼠的認(rèn)知能力[3]。</p><p>　　以上的這些功能足以證明白藜蘆醇的重要保健作用，后續(xù)的研究中還發(fā)現(xiàn)在變態(tài)反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒等過程中，白藜蘆醇也會(huì)產(chǎn)生一定的影響。相比與其它保健分子，白藜蘆醇的典型優(yōu)勢(shì)是能夠直接食用和吸收，因此，人們嘗試將白藜蘆醇作為食品添加劑，添加到藥品、食物、飲料甚至化妝品中，作為一種新型的美容保健品

47、，進(jìn)而達(dá)到美容養(yǎng)顏，抗衰老的目的。這無疑對(duì)于保健品市場(chǎng)來講，白藜蘆醇會(huì)發(fā)揮重要作用。</p><p>　　1.2.3 Sir2家族在機(jī)體衰老過程中發(fā)揮重要作用</p><p>　　沉默配型信息調(diào)節(jié)蛋白是一類廣泛存在于生物體，與壽命調(diào)控相關(guān)的蛋白質(zhì)，在酵母體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了其家族的首個(gè)成員SIR2，過表達(dá)SIR2能夠有效抑制rDNA(ribosomal DNA)重復(fù)序列的重組，從而延長酵母壽命[6]

48、。這個(gè)家族族中共有七位成員，其中被研究最廣泛的，也被發(fā)現(xiàn)功能最重要的是SIRT1蛋白。SIRT1 能夠?qū)⒁职┗騪53 特異位點(diǎn)的賴氨酸殘基去乙?；瑥亩种屏藀53 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，這就使細(xì)胞能夠繼續(xù)分裂生長。而腫瘤抑制因子DBC1 是SIRT1 的一個(gè)負(fù)調(diào)控因子，由于抑制了SIRT1的表達(dá)，DBC1 促進(jìn)腫瘤抑制因子p53 發(fā)生更多乙?；磻?yīng)，從而促使人類細(xì)胞發(fā)生由p53 誘導(dǎo)的凋亡。此外，SIRT1 還能夠通過抑制DNA 修復(fù)因子

49、的乙?；?，阻止Bax 轉(zhuǎn)位到線粒體，從而抑制細(xì)胞凋亡。但也有研究認(rèn)為SIRT1 可增強(qiáng)p19ARF /p53 信號(hào)通路的活性，誘導(dǎo)體內(nèi)細(xì)胞進(jìn)入復(fù)制性凋亡[17]。</p><p>　　堅(jiān)持減少飲食中熱量的攝入，從而延長壽命的方法，被稱為限制熱量攝取，即熱量限制。 有研究認(rèn)為熱量限制之所以能夠延長壽命是與SIRT1 的活性有關(guān)。攝取較少熱量會(huì)延長生命周期，但卻容易引起許多的副作用。FOXO基因家族，是與脂肪代謝密切

50、相關(guān)的，而SIRTl 被證明能夠調(diào)控這個(gè)家族成員的表達(dá)，從而達(dá)到延長壽命的效果。FOXO基因家族不僅與脂肪代謝密切相關(guān)，在動(dòng)物的繁殖、壽命、腫瘤發(fā)生等免疫過程相關(guān)的細(xì)胞凋亡調(diào)控過程中，F(xiàn)OXO 家族成員起重要作用。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，F(xiàn)OXO 是SIRT1 的直接和功能性的調(diào)控靶點(diǎn)，SIRT1 能夠使FOXO3a 和其他FOXO 家族成員發(fā)生去乙?；M(jìn)而抑制了其轉(zhuǎn)錄調(diào)控活力，達(dá)到促進(jìn)存活、抵抗凋亡的作用。SIRT1 還能通過抑制過氧化物酶

51、體增殖物激活受體(Peroxisome proliferators activataedreceptor-γ, PPAR-γ) 的活性來消耗白色脂肪組織(Whiteadiposetissue, WAT)， 從而降低了體內(nèi)脂質(zhì)過氧化積累，這種效應(yīng)在胰島素敏感性治療方面起重要作用[6]。</p><p>　　圖1.1 SIRT1 與多種細(xì)胞因子相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖</p><p>　　白藜蘆醇

52、作為SIRT1 的激活劑，通過激活SIRT1 來調(diào)控不同信號(hào)及代謝途徑，從而發(fā)揮生物學(xué)功能[8]。</p><p>　　SIRT6具有兩種酶活性，單ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶活性和去乙?；富钚裕@兩個(gè)酶功能與SIRT6功能實(shí)現(xiàn)有密切關(guān)系。與SIRT1相比，SIRT6去乙?；富钚暂^弱，作用底物也較少，這也是為什么SIRT6在被發(fā)現(xiàn)幾年后其酶活性才得到肯定的原因。衰老的重要表現(xiàn)之一就是基因組不穩(wěn)定，多項(xiàng)研究表明SIRT6

53、通過促進(jìn)DNA損傷修復(fù)，而具有抗衰老的功能。端粒的長度被用來衡量細(xì)胞的衰老程度，隨著機(jī)體年齡的增加和細(xì)胞復(fù)制次數(shù)增多，鍛煉的長度會(huì)逐漸縮短。但在永生化的細(xì)胞(如腫瘤細(xì)胞)中，由于端粒酶的存在，端粒能維持恒定的長度。當(dāng)把小鼠的SIRT6基因敲除掉以后，小鼠會(huì)表現(xiàn)出與人類的Werner綜合征相似的衰老特征，Werner綜合征的患病原因是一種解旋酶WRN(Werner syndrome ATP-dependent helicase)有缺陷，這

54、種缺失會(huì)導(dǎo)致端粒功能障礙，進(jìn)而使機(jī)體表現(xiàn)出與正常年齡不符的衰老特征。此外，當(dāng)將WI-38細(xì)胞中的SIRT6基因特異性敲除后，通過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的分裂能力降低，通過染色發(fā)現(xiàn)β-半乳糖苷酶表達(dá)明顯增多，同時(shí)還出現(xiàn)端粒功能失調(diào)，染色體末端融合等衰老特征。而將端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶</p><p>　　1.2.4 SIRT6通過與NF-κB作用調(diào)控炎癥反應(yīng)和腫瘤發(fā)生</p><p>　　核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB

55、是在炎癥，衰老和凋亡中起著重要作用的轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB信號(hào)在衰老的組織器官中表達(dá)上調(diào)。在應(yīng)激條件下，與NF-κB結(jié)合的抑制子IKK(inhibitor of nuclearfactor κB kinase)解離，IKK經(jīng)泛素化降解，而NF-κB進(jìn)入胞核，引起靶基因的表達(dá)。目前已知，SIRT6與NF-κB的核心亞基RelA存在直接接觸，使RelA調(diào)控的靶基因啟動(dòng)子部位的H3K9去乙酰化，從而RelA與染色質(zhì)結(jié)合不穩(wěn)定，最終終止NF-κB

56、信號(hào)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，抑制靶基因的表達(dá)。在SIRT6基因敲除小鼠中，可觀察到NF-κB信號(hào)過度激活，而RelA亞基基因單倍缺失的小鼠卻能夠逆轉(zhuǎn)由于SIRT6基因敲除而導(dǎo)致的早衰癥狀，小鼠的壽命也趨近于正常[18]。這些研究表明SIRT6能通過抑制NF-κB炎癥信號(hào)延緩機(jī)體衰老。</p><p>　　此外，利用基因芯片進(jìn)行的研究表明在SIRT6調(diào)控的基因和RelA調(diào)節(jié)的基因中，有很大一部分是相同的，這些基因包括與衰老

57、相關(guān)的細(xì)胞周期依賴性激酶抑制基因2A(cyclin-dependent kinase inhibitor 2A, cdkn2a)與Shc1(src homology 2 domain-containing transforming protein C1)等[18]。衰老的另外一個(gè)標(biāo)志性分子p16隨年齡的增長而增多，的原因已被證實(shí)與NF-κB信號(hào)有關(guān)。以上研究結(jié)果顯示，SIRT6和NF-κB對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)控是通過相互拮抗作用來維持平衡的，

58、進(jìn)而達(dá)到控制衰老進(jìn)程的目的。</p><p>　　眾所周知，腫瘤細(xì)胞具有與普通細(xì)胞不同的特性，具體表現(xiàn)為不穩(wěn)定的基因組、不可控的細(xì)胞增殖等，其在能量供應(yīng)上也具有獨(dú)特的特點(diǎn)，可以通過無氧呼吸來提供能量，因此在生存能力上有很強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。之前討論過SITR6在維持基因組穩(wěn)定、調(diào)控糖代謝等方面都發(fā)揮重要作用，根據(jù)腫瘤的特點(diǎn)，可以推斷SIRT6不僅能夠調(diào)控機(jī)體衰老，在腫瘤調(diào)控上也有重要作用。2012年，研究發(fā)現(xiàn)在對(duì)二乙基亞硝

59、胺誘導(dǎo)的小鼠肝癌模型中，發(fā)現(xiàn)了SIRT6的重要作用，可以在肝癌的起始階段發(fā)揮重要調(diào)節(jié)功能。此時(shí)癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子c-Jun可以抑制 c-fos作用，而 c-fos能促進(jìn)SIRT6的轉(zhuǎn)錄，后者通過對(duì)組蛋白的去乙酰化調(diào)控NF-ΚB，最終抑制survivin蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)凋亡，抑制起始階段腫瘤的產(chǎn)生。在腫瘤產(chǎn)生的起始階段，survivin和c-Jun的高表達(dá)也從反面印證了這點(diǎn)。但以上的現(xiàn)象僅發(fā)生于腫瘤的起始階段，對(duì)于腫瘤的發(fā)展期和末期則不存在，

60、而且c-Jun的促癌作用與抑癌基因P53的關(guān)系并不密切[19]。</p><p>　　虛線部分僅存在于腫瘤的形成期，箭頭表示促進(jìn)關(guān)系。在應(yīng)激作用下，機(jī)體SIRT6表達(dá)上調(diào)，通過抑制NF-κB信號(hào)通路，抑制糖酵解和促 DNA的修復(fù)作用，從而抑制腫瘤的形成。NF-κB信號(hào)通路主要參與促進(jìn)細(xì)胞死亡，炎癥和代償性增生。此外，過表達(dá)SIRT6的腫瘤細(xì)胞會(huì)在P53和P73分別作用下凋亡，然而，其中的作用機(jī)制尚不清楚。在肝癌形

61、成早期，c-Jun會(huì)抑制c-fos的表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)SIRT6。</p><p>　　圖1.2 SIRT6與腫瘤形成的關(guān)系</p><p><b>　　論文構(gòu)成及研究內(nèi)容</b></p><p>　　論文包括研究背景、現(xiàn)狀分析、研究方案、實(shí)驗(yàn)結(jié)果、分析討論、實(shí)驗(yàn)結(jié)論、參考文獻(xiàn)等幾個(gè)部分。重點(diǎn)是檢測(cè)手段和對(duì)檢測(cè)結(jié)果的分析。試驗(yàn)中對(duì)經(jīng)過不同飼養(yǎng)條件

62、的小鼠的腎臟組織分別進(jìn)行HE、Masson、PAS、β-gal染色，從染色的結(jié)果中分析腎臟病理情況以及衰老情況，采用統(tǒng)計(jì)的方法對(duì)切片結(jié)果進(jìn)行分析；采用Western-blot來檢測(cè)SIRT6的蛋白量和NF-κB的乙?；剑ㄟ^Real-time PCR來檢測(cè)Sirt6d的RNA水平，這從分子的角度對(duì)腎臟的衰老情況進(jìn)行了評(píng)估，并且嘗試著對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行解釋，最后得出白藜蘆醇對(duì)高脂飲食給腎臟帶來的損傷是否有緩解作用，以及對(duì)于正常飲食條件下的

63、腎臟組織，白藜蘆醇是否有進(jìn)一步的改善作用。</p><p><b>　　2 研究方案</b></p><p><b>　　研究目標(biāo)</b></p><p>　　衰老一直是人們密切關(guān)注的問題，隨著人們生活水平的提高，越來越多的人開始追求更長的壽命和更健康的晚年，于是關(guān)于衰老的研究成為了熱點(diǎn)。對(duì)于衰老的機(jī)制，目前有許多觀點(diǎn)，

64、更容易被大家接受的是這幾種機(jī)制混合發(fā)揮作用，即網(wǎng)絡(luò)機(jī)制。能夠有效延緩衰老的小分子化合物逐漸被人們發(fā)現(xiàn)，其中白藜蘆醇被多次證明能夠有效延緩衰老，防止老年化疾病，但對(duì)于具體器官的影響還并不明確，腎臟作為人體中最重要的器官之一，它的衰老會(huì)嚴(yán)重影響機(jī)體的健康，于是本研究的目的是探究白藜蘆醇是否會(huì)有效改善高脂飲食引起的腎臟衰老。</p><p>　　本試驗(yàn)中采用了高脂飲食、高脂飲食加白藜蘆醇、正常飲食、正常飲食加白藜蘆醇四

65、種培養(yǎng)方式來飼養(yǎng)小鼠，每組六只。培養(yǎng)三個(gè)月后，對(duì)每只小鼠的腎臟進(jìn)行切片染色觀察；此外，提取組織的總蛋白和RNA，通過Western-blot和Real-time PCR檢測(cè)衰老相關(guān)蛋白的表達(dá)量，采用統(tǒng)計(jì)分析的方法得出結(jié)論，確定白藜蘆醇對(duì)高脂飲食引起的腎臟衰老是否有緩解作用，以及是否能夠進(jìn)一步改善正常飲食小鼠腎臟的健康程度，并且進(jìn)一步從分子角度解釋白藜蘆醇發(fā)揮作用機(jī)制，從而為腎臟衰老研究提供靶點(diǎn)，為腎臟疾病治療藥物和保健藥物的研究提供依據(jù)

66、。</p><p>　　儀器設(shè)備、材料、試劑藥品的選擇</p><p><b>　　儀器設(shè)備：</b></p><p>　　熒光倒置相差顯微鏡、超凈臺(tái)及其附屬器材、4度離心機(jī)、冰箱、液氮罐、分析天平、恒溫箱、高壓滅菌鍋、烘箱、微量移液器、磁力攪拌器、手術(shù)器械、PH計(jì)、恒冷冰凍切片機(jī)、生物光學(xué)顯微鏡及U-SPT照相系統(tǒng)、紫外分光光度計(jì)醫(yī)學(xué)圖像分析

67、系統(tǒng)、PCR儀、酶標(biāo)儀、電泳裝置、轉(zhuǎn)模裝置</p><p><b>　　材料：</b></p><p>　　SPF級(jí)的雄性小鼠（SAMP1），三月齡，體重20—25克，購自清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物平臺(tái)，通過高脂飲食、高脂飲食加白藜蘆醇、正常飲食、正常飲食加白藜蘆醇四種培養(yǎng)方式培養(yǎng)三個(gè)月，每組各6只</p><p><b>　　試劑藥品：

68、</b></p><p>　　PBS、總RNA提取試劑Trizol試劑盒、BCA擴(kuò)增試劑盒、DEPC、 酒精、石蠟、二甲苯、蘇木精、硫酸、氨水、中性樹膠、伊紅染色液、Masson復(fù)合染色液、5%磷鉬酸、苯胺藍(lán)、分化液、β—半乳糖苷酶染色試劑盒、0.5%過碘酸水溶液、Schiff試劑、偏重亞硫酸納、蛋白酶裂解液、氯仿、異丙醇、反轉(zhuǎn)錄試劑盒</p><p><b>　　抗

69、體：</b></p><p>　　兔抗小鼠SIRT6多克隆抗體（Cell Signaling Technology公司）</p><p>　　兔抗小鼠NF-κB p65單克隆抗體 （Cell Signaling Technology公司）</p><p>　　兔抗小鼠乙?；疦F-κB p65多克隆抗體（香港Abcam公司） </p><

70、;p>　　山羊抗兔單克隆抗體（Cell Signaling Technology公司）</p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)內(nèi)容</b></p><p>　　2.3.1提取小鼠腎臟組織分裝保存</p><p>　　將三月齡的小鼠分別在高脂飲食、高脂飲食加白藜蘆醇、正常飲食、正常飲食加白藜蘆醇四種培養(yǎng)方式下培養(yǎng)三個(gè)月，頸椎脫臼處死；</p

71、><p>　　在超凈臺(tái)中，解剖大鼠，取出腎臟組織，預(yù)先配好的固定液中，使組織、細(xì)胞的蛋白質(zhì)變性凝固，以防止細(xì)胞死后的自溶或細(xì)菌的分解，從而保持細(xì)胞本來的形態(tài)結(jié)構(gòu)；</p><p>　　分割出一部分組織置于離心管中放入—80攝氏度冰箱保存，以備提取總蛋白和總RNA。</p><p>　　2.3.2 將腎臟組織包埋切片、染色觀察</p><p>　　

72、2.3.2.1對(duì)組織進(jìn)行包埋、切片</p><p>　　脫水透明：用由低濃度到高濃度酒精作脫水劑，逐漸脫去組織塊中的水份。再將組織塊置于既溶于酒精，又溶于石蠟的透明劑二甲苯中透明，以二甲苯替換出組織塊的中酒精。</p><p>　　浸蠟包埋：將已透明的組織塊置于已溶化的石蠟中，放入溶蠟箱保溫。待石蠟完全浸入組織塊后進(jìn)行包埋：先制備好容器，倒入已溶化的石蠟，迅速夾取已浸透石蠟的組織塊放入其中

73、，冷卻凝固成塊。</p><p>　　切片與貼片：將包埋好的蠟塊固定于切片機(jī)上，切成薄片，一般為5—8微米厚。切下的薄片往往皺折，要放到加熱的水中燙平，再貼到載玻片上，放45℃恒溫箱中烘干。</p><p>　　2.3.2.2 對(duì)組織進(jìn)行HE染色</p><p>　　將片子放入二甲苯中脫蠟；</p><p>　　經(jīng)從高濃度到低濃度的酒精脫水，

74、最后放入蒸餾水中；</p><p>　　放入蘇木精水溶液中染色數(shù)分鐘；</p><p>　　酸水及氨水中分色，各數(shù)秒鐘；</p><p>　　流水沖洗后入蒸餾水片刻；</p><p>　　入酒精伊紅染色液染色2—3分鐘；</p><p>　　蒸餾水沖洗，經(jīng)酒精脫水；</p><p>　　經(jīng)二甲苯

75、使切片透明；中性樹膠封固，顯微鏡下觀察。</p><p>　　2.3.2.3 對(duì)組織進(jìn)行Masson染色</p><p>　　石蠟切片4微米，常規(guī)脫蠟至水；</p><p>　　Masson復(fù)合染色液染色5分鐘，蒸餾水沖掉染液；</p><p>　　5%磷鉬酸染色5分鐘，甩干；</p><p>　　直接用苯胺藍(lán)染色5分

76、鐘，蒸餾水稍微沖洗；</p><p>　　分化液分化30-60秒；</p><p>　　無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。</p><p>　　2.3.2.4 對(duì)組織進(jìn)行β—半乳糖苷酶染色</p><p>　　OCT包埋的腎組織冰凍切片8微米，室溫下晾干20—30分鐘；</p><p>　　0.1M

77、 PBS（PH約為7.0）固定十分鐘，PBS沖洗切片；</p><p>　　至于濕盒中，滴加新鮮配置的SA-β-gal孵育液（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷1mg/ml，40mmol/L檸檬酸緩沖液，5mmol/L亞鐵氰化鉀，5mmol/L鐵氰化鉀，150mmol/LNaCL，2mmol/L MgCL2,PH 6.0） 37攝氏度孵育20小時(shí)；</p><p>　　流水輕輕沖去

78、染色液，伊紅復(fù)染2分鐘；</p><p>　　自來水沖洗完全，烤片，中性樹膠封片，鏡檢。</p><p>　　2.3.2.5 對(duì)組織進(jìn)行PAS染色</p><p>　　石蠟切片4微米，常規(guī)脫蠟至水，蒸餾水浸洗1分鐘；</p><p>　　0.5%過碘酸水溶液氧化1分鐘，蒸餾水洗3次，每次3分鐘；</p><p>　　于

79、暗處Schiff試劑染色20分鐘，傾去染液；</p><p>　　直接用偏重亞硫酸納沖洗液沖洗切片2次，每次一分鐘，</p><p>　　流水沖洗10分鐘，使之顯現(xiàn)紅色；</p><p>　　蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，常規(guī)脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡檢。</p><p>　　2.3.3 Western-blot檢測(cè)衰老相關(guān)蛋白質(zhì)含量</p

80、><p>　　2.3.3.1 提取組織總蛋白</p><p>　　將組織在冰盒上融化，每個(gè)EP管中有大約200mg腎臟組織；</p><p>　　在每個(gè)EP管中加入200微升蛋白酶裂解液；</p><p><b>　　用組織勻漿器攪拌；</b></p><p>　　在冰盒上裂解30分鐘；</p&

81、gt;<p>　　4攝氏度離心，10000g，15分鐘；</p><p>　　取上清，—80攝氏度冰箱保存。</p><p>　　2.3.3.2 Western-blot </p><p>　　蛋白質(zhì)變性：采用BCA法測(cè)量蛋白濃度，按照蛋白質(zhì)含量為50μg配置蛋白質(zhì)混合液，在沸水中變性；（BCA法測(cè)蛋白質(zhì)濃度詳細(xì)步驟見附錄A）</p>

82、<p>　　清洗玻璃板：兩面都擦洗過后用自來水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干；</p><p>　　配置濃縮膠與分離膠；</p><p>　　灌膠與上樣：每個(gè)孔加入20μml；</p><p>　　電泳：90V，2.5h；</p><p>　　轉(zhuǎn)模：70V，3h；</p><p><b>　　

83、封閉液封閉1h;</b></p><p>　　加入一抗，在室溫下?lián)u2h；</p><p>　　洗去一抗，加入二抗；</p><p>　　洗去二抗，加入顯色液在暗室顯影，分析結(jié)果。（詳細(xì)步驟見附錄B）</p><p>　　2.3.4 Real-time PCR檢測(cè)衰老相關(guān)蛋白對(duì)應(yīng)RNA含量</p><p>　

84、　2.3.4.1 提取組織總RNA</p><p>　　提前用DEPC水處理勻漿器的槍頭，以及手術(shù)器械，出去RNA酶；</p><p>　　每個(gè)EP管大約有200ug組織，每管加入1mLTrizol；</p><p>　　用組織勻漿器將組織徹底攪勻，室溫靜置5分鐘；</p><p>　　加入200ul氯仿，劇烈震蕩15秒，室溫放置2分鐘；&l

85、t;/p><p>　　4攝氏度，12000rpm，；離心15分鐘；</p><p>　　將上清移入另外一個(gè)離心管中，加入500ul異丙醇，混勻，室溫放置10分鐘；</p><p>　　4攝氏度，12000rpm離心10分鐘，去上清；</p><p>　　加入75%乙醇洗滌，4攝氏度，8000rpm離心5分鐘，去乙醇；</p><

86、;p>　　沉淀用DEPC水溶解，紫外分光光度計(jì)測(cè)濃度，分裝保存與—80攝氏度。</p><p>　　2.3.4.2 Real-time PCR</p><p>　　搜索近兩年發(fā)表在nature雜志上的相關(guān)文獻(xiàn)，查找所需蛋白的qPCR引物序列，托送給引物合成公司合成引物，引物序列如下：</p><p>　　m-SIRT6 qPCR117-F CC

87、TGGTCAGCCAGAACGTAG</p><p>　　m-SIRT6 qPCR117-R TACTGCGTCTTACACTTGGGA</p><p>　　m-GAPDH qPCR104-F CATGGCCTTCCGTGTTCCTA</p><p>　　m-GAPDH qPCR104-R CCTGCTTCACCACCTTCTTGAT

88、</p><p>　　取各樣品的1-5 mg總RNA模板，利用Super Script TM III Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄酶（Invitrogen, USA），將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，用于Real-time PCR實(shí)驗(yàn)。（RT-PCR具體操作流程見附錄C）</p><p>　　2.3.5 結(jié)果檢測(cè)與分析方法</p><p>　　2.3

89、.5.1 HE與PAS染色結(jié)果評(píng)價(jià)方法</p><p>　　小管—間質(zhì)損傷定義：小管萎縮擴(kuò)張，小管內(nèi)管型，小管基底膜增厚，細(xì)胞浸潤和間質(zhì)增寬。</p><p>　　損傷評(píng)分： 0分，腎小管間質(zhì)無明顯病變；0.5分，小的局炤性的小管間質(zhì)損傷；1分，皮質(zhì)區(qū)小于10%的小管間質(zhì)損傷；2分，皮質(zhì)區(qū)存在10%-25%的小管間質(zhì)損傷；3分，皮質(zhì)區(qū)存在25%-75%的小管間質(zhì)損傷； 4分，皮質(zhì)區(qū)存在大于

90、等于75%的小管間質(zhì)損傷。每張切片按順時(shí)針方向隨機(jī)選取20個(gè)腎小管-間質(zhì)視野計(jì)算平均值。</p><p>　　2.3.5.2 Masson染色結(jié)果評(píng)價(jià)方法</p><p>　　腎小管間質(zhì)纖維化指數(shù)：采用Image-Pro Plus Version 6.0 醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，在同一條件下，對(duì)每張標(biāo)本選取15個(gè)不重復(fù)視野，將呈現(xiàn)為藍(lán)色的纖維區(qū)域（去腎小球和大血管）視作陽性目標(biāo)，以陽性面積和統(tǒng)計(jì)

91、場(chǎng)總面積的比值作為腎小管間質(zhì)的纖維化指數(shù)。</p><p>　　2.3.5.2β-半乳糖苷酶染色結(jié)果評(píng)價(jià)方法</p><p>　　衰老細(xì)胞染成藍(lán)靛色，顯微鏡下，每張切片按順時(shí)針方向隨機(jī)選取20個(gè)視野， 結(jié)果采用半定量評(píng)分，0分，無陽性染色出現(xiàn)；1分，偶見小管內(nèi)有微弱染色；2分，部分小管節(jié)段出現(xiàn)陽性染色；3分，大部分小管出現(xiàn)彌漫性陽性染色，計(jì)算每張切片得分的平均值。</p>&

92、lt;p>　　2.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理</p><p>　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果以數(shù)據(jù)和圖表表示，測(cè)定值以平均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SigmaStat 3.5 軟件包分析，組間比較用t檢驗(yàn)。P<0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，在結(jié)果圖中，使用 * 標(biāo)注出來。</p><p><b>　　3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果</b></p><p><b>　　PAS染色

93、結(jié)果</b></p><p>　　高脂飲食組發(fā)現(xiàn)腎小管基底膜增厚，小管間質(zhì)大量炎性細(xì)胞浸潤，小管內(nèi)管型，小管擴(kuò)張、萎縮、壞死等，病變嚴(yán)重區(qū)域可見腎小球肥大，系膜增生，節(jié)段性腎小球硬化。從染色程度深淺來看，高質(zhì)飲食組被染程度最深；高脂飲食加入白藜蘆醇后，腎組織形態(tài)比較正常，被染色程度相對(duì)較淺，說明其糖類物質(zhì)含量比較低；對(duì)于正常飲食組，腎組織形態(tài)比較完整，染色程度十分淺；當(dāng)加入白藜蘆醇后，腎組織形態(tài)無明顯

94、變化，但染色程度比正常飲食組稍深一些，這個(gè)現(xiàn)象在幾個(gè)樣本中都有體現(xiàn)，具體原因還有待分析。見圖3.1、圖3.2。</p><p>　　圖3.2 PAS染色統(tǒng)計(jì)結(jié)果</p><p><b>　　HE染色結(jié)果</b></p><p>　　從染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過三個(gè)月的高脂飲食，小鼠的腎小管官腔堆積蛋白并出現(xiàn)纖維化前兆，腎小管上皮細(xì)胞變下、壞死，腎小管

95、腫脹明顯，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞數(shù)量減少，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞包裹腎小球區(qū)域有壞死區(qū)域；高脂飲食加入白藜蘆醇后，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞空泡及腫脹與單純高質(zhì)飲食相比有所緩解；正常飲食組的腎小球及腎小管均較正常，加入白藜蘆醇后腎小球的狀態(tài)更健康，但由于正常飲食的腎小球本來病變程度就很低，因此加入白藜蘆醇后，差別很不明顯。根據(jù)此現(xiàn)象可以推斷，白藜蘆醇對(duì)高脂飲食給腎組織帶來的傷害有改善作用，而對(duì)于正常飲食的小鼠腎臟組織影響不大。見圖3.3、圖3.4。

96、</p><p>　　圖3.4 HE染色統(tǒng)計(jì)結(jié)果</p><p>　　Masson染色結(jié)果</p><p>　　染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高脂飲食組彌漫的腎小管基底膜增厚皺縮，小管上皮細(xì)胞水腫、變性、壞死；小官彌漫性囊狀擴(kuò)張、萎縮，局炤性小管消失，間質(zhì)增寬，膠原纖維含量顯著增加，可以看見廣泛強(qiáng)烈的藍(lán)色著色，小管間質(zhì)的纖維化比較明顯、部分小管間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤等等；高脂飲食加入白

97、藜蘆醇后，藍(lán)色著染程度降低，但仍能發(fā)現(xiàn)明顯著染區(qū)域，腎小球與腎小管形態(tài)比較正常，但部分樣本的切片仍能發(fā)現(xiàn)明顯病變；正常飲食組偶爾會(huì)在腎小球鮑曼氏囊和基底膜處有少量藍(lán)色著染，間質(zhì)膠原纖維含量比較少，小管結(jié)構(gòu)無明顯異常；加入白藜蘆醇后，著染程度與正常飲食組相差不大，小管結(jié)構(gòu)也比較正常。見圖3.5、圖3.6。</p><p>　　圖3.6 Masson 染色統(tǒng)計(jì)結(jié)果</p><p>　　SA-

98、β-gal 染色結(jié)果</p><p>　　染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，染色陽性的細(xì)胞均定為在腎小管中，在腎小球中鮮有表達(dá)。高脂飲食的小鼠腎臟組織中衰老細(xì)胞明顯較多，大部分腎小管出現(xiàn)彌漫性陽性染色；高脂飲食加入白藜蘆醇后的小鼠腎臟組織陽性表達(dá)率相對(duì)較低，故可認(rèn)為其腎臟衰老情況相對(duì)有所緩解；對(duì)于正常飲食的小鼠，其組織陽性表達(dá)率普遍比較低；正常飲食加入白藜蘆醇后與單純正常飲食相比沒有明顯變化。見圖3.7、圖3.8。</p>

99、;<p>　　圖3.8 SA-β-gal 染色統(tǒng)計(jì)結(jié)果</p><p>　　Western-blot 結(jié)果</p><p>　　通過Western-blot技術(shù)，檢測(cè)了四種不同方式喂養(yǎng)的小鼠的組織總蛋白，發(fā)現(xiàn)SIRT6和乙?；腘F-κB的表達(dá)量有明顯區(qū)別，而總NF-κB的表達(dá)量沒有明顯變化。對(duì)于高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠腎組織中，SIRT6表達(dá)量很低，乙?；腘F-κB百分比較高

100、；加入白藜蘆醇后，SIRT6表達(dá)量相對(duì)升高，并且乙?；腘F-κB百分比相對(duì)下降；對(duì)于正常飲食的小鼠的腎臟組織中，SIRT6表達(dá)量比較高，且乙?；腘F-κB百分比較低；當(dāng)加入白藜蘆醇后，二者的含量并沒有明顯變化。結(jié)果見圖3.9。</p><p>　　Real-time PCR 結(jié)果</p><p>　　通過Real-time PCR技術(shù)，檢測(cè)了不同組織中SIRT6的mRNA水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)

101、，在高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠腎臟組織中，SIRT6 mRNA水平比較低；加入白藜蘆醇后，組織中SIRT6 的mRNA水平有所上升；在正常飲食喂養(yǎng)的小鼠腎臟組織中發(fā)現(xiàn)SIRT6 的mRNA水平比之前兩組水平高；加入白藜蘆醇后，SIRT6 的mRNA水平有所升高，其趨勢(shì)與蛋白表達(dá)量的趨勢(shì)基本一致。見圖3.10。</p><p>　　圖3.10 SIRT6 mRNA水平統(tǒng)計(jì)結(jié)果</p><p><

102、;b>　　4 討論與展望</b></p><p>　　高脂飲食誘導(dǎo)腎臟衰老</p><p>　　本試驗(yàn)中設(shè)置了四種培養(yǎng)方式，其中單純高脂飲食的飼養(yǎng)方法，使該組的小鼠腎臟明顯發(fā)生了早老的現(xiàn)象。從整體角度來講，三個(gè)月的高脂飲食飼養(yǎng)的小鼠在外觀上更顯肥胖，體重相對(duì)其他組較高，加入白藜蘆醇后體重稍稍降低，但仍比正常飲食組體重高。對(duì)腎臟組織的分析中發(fā)現(xiàn)，四種染色結(jié)果都顯示了高脂飲

103、食組的小鼠腎臟有明顯的衰老特點(diǎn)，纖維化程度高，糖類物質(zhì)含量高，腎小球膨大，腎小囊與腎小管有病變趨勢(shì)。因此高脂飲食確實(shí)能夠誘導(dǎo)腎臟的提前衰老。</p><p>　　高脂飲食能夠引起腎臟提前衰老的原因可能與動(dòng)脈粥樣硬化和糖尿病有關(guān)，有研究報(bào)道稱高脂飲食能夠引起血漿中的甘油三酯和游離脂肪酸水平增高，游離脂肪酸可以通過胰島素信號(hào)傳導(dǎo)、糖脂肪酸循環(huán)等多個(gè)不同途徑來抑制糖儲(chǔ)存，降低胰島素的敏感性，進(jìn)而導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生[2

104、0]。</p><p>　　糖尿病腎病是糖尿病嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥。這種病的發(fā)生率在患有2型糖尿病后的20~25年高達(dá)50%。2型糖尿病腎病的患者在臨床上表現(xiàn)為高血壓、持續(xù)的蛋白尿和進(jìn)行性腎功能損害；在組織學(xué)上會(huì)表現(xiàn)為腎臟肥大和腎組織大量細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生積聚。2型糖尿病腎病和1型糖尿病腎病在主要組織學(xué)上的改變基本相似，但2型糖尿病腎病在形態(tài)學(xué)上的改變更為多樣性，其中非特異性的間質(zhì)損傷和血管損傷更為常見。這種疾病的典型表

105、現(xiàn)為系膜擴(kuò)張或腎小球硬化，同時(shí)還伴有腎小球基底膜增厚、小動(dòng)脈透明樣變、小管萎縮和間質(zhì)纖維化等病變。不典型的病例僅有血管和腎小管間質(zhì)的病變而沒有或輕微有腎小球的病變[21]。</p><p>　　高脂血癥在2型糖尿病導(dǎo)致的腎損傷中起到了重要作用。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和相關(guān)臨床研究中表明，高膽固醇血癥可以誘發(fā)甚至加重腎小球的硬化和腎小管的損傷。當(dāng)血液中膽固醇含量過高時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)血液中單核細(xì)胞趨化因子MCP-1的表達(dá)，當(dāng)MCP-1