槌果藤乙醇提取物對進行性系統(tǒng)性硬化癥患者成纖維細胞Ⅰ型膠原產(chǎn)生的影響及其作用機理研究.pdf

1、[研究背景] 進行性系統(tǒng)性硬化癥(PSS)是以局限性或彌漫性皮膚和內(nèi)臟器官結(jié)締組織的纖維化或硬化，最后導致功能障礙為特點的疾病，PSS患者的成纖維細胞胞外基質(zhì)(ECM)合成增加是皮膚、內(nèi)臟纖維硬化的主要原因之一，其中尤以Ⅰ型膠原增多顯著。TGF-β、CTGF是主要的促纖維化細胞因子，在PSS中表達增高，通過促進膠原等基質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄及合成參與PSS的發(fā)病。分解減少是PSS患者ECM堆積的另一重要原因，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)及其

2、抑制劑金屬蛋白酶組織抑制物(TIMPs)是關鍵的ECM降解酶體系，TIMPs與活化狀態(tài)的MMPs以1:1克分子比例非共價結(jié)合，抑制MMPs的活性。其中MMP-1、MMP-3及TIMP-1、TIMP-3與PSS患者發(fā)病關系密切，PSS患者TIMP-1，3產(chǎn)生增加，MMP-1，3合成減少、活性降低導致ECM降解減少。近年來研究表明氧化應激參與硬皮病的發(fā)病，PSS患者的單核細胞、成纖維細胞產(chǎn)生02-、H2O2水平顯著高于正常人，細胞內(nèi)活性氧(

3、ROS)水平明顯增加，增高的ROSS僅可通過ROS—ERK1／2-Ha-Ras信號鏈，而且可通過誘導TGF-β1、CTGFmRNA表達和活化促進膠原等基質(zhì)基因表達，并且可誘導PAI、TIMP-3合成，減少基質(zhì)降解。 槌果藤在新疆作為一種民族藥而被廣泛應用，化學研究表明：槌果藤中含有揮發(fā)油(異硫氰酸酯、麝香草酚、棕櫚酸等)、吲哚類、類黃酮類、谷甾醇類、葡萄糖異硫氰酸鹽及一些結(jié)構(gòu)新穎的化合物，藥理學研究表明，槌果藤具有抗菌、抗炎、抗

4、氧化、保肝、降血脂血糖等作用，其中抗氧化作用尤其引人矚目。曾有報道用槌果藤鮮果泥膏外敷治療局限性硬皮病，療效顯著，但局部刺激反應明顯，并缺乏藥理、作用機理方面的研究報道。研究槌果藤乙醇提取物對PSS患者成纖維細胞膠原產(chǎn)生的影響及作用機理探討有助于該藥的進一步開發(fā)應用。 [目的] 明確槌果藤乙醇提取物對PSS患者成纖維細胞增殖、I型膠原mRNA表達、蛋白合成的影響，通過研究槌果藤乙醇提取物對PSS患者成纖維細胞TGF-β1

5、、CTGF，ECM降解酶體系(MMP-1，3、TIMP-1，3)及活性氧水平的影響探討該提取物是否通過抑制促纖維化細胞因子表達、促進降解或抗氧化應激而發(fā)揮其抗纖維化作用。并排除該提取物的細胞毒性。 [方法] 第一部分：正常人、PSS患者成纖維細胞的分離、原代培養(yǎng)，提取總RNA和蛋白質(zhì)。以MTT法檢測槌果藤乙醇提取物對PSS患者成纖維細胞增殖的影響；以AnnexinV-FITC／PI染色用流式細胞儀檢測該提取物對PSS患者

6、成纖維細胞凋亡的影響；以逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(Reverse transcript polymerase chain reaction, RT-PCR)檢測該提取物對PSS患者成纖維細胞I型膠原mRNA表達的影響；以Western-blot法檢測該提取物對PSS患者成纖維細胞Ⅰ型膠原蛋白合成的影響。 第二部分：以逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(Reverse transcript polymerase chain reaction，RT-

7、PCR)檢測該提取物對PSS患者成纖維細胞TGF-β1、CTGF、ECM降解酶體系(MMP-1，3、TIMP-1，3)mRNA表達的影響；以免疫熒光法、Western-blot法檢測該提取物對PSS患者成纖維細胞TGF-β1、CTGF蛋白表達的影響。 第三部分：用細胞色素C還原法檢測該提取物對PSS患者成纖維細胞超氧陰離子產(chǎn)生的影響；用高香草酸一辣根過氧化酶法檢測該提取物對PSS患者成纖維細胞過氧化氫產(chǎn)生的影響；用DCFH-DA

8、熒光探針經(jīng)熒光纖維鏡觀察、流式細胞儀檢測該提取物對PSS患者成纖維細胞內(nèi)ROS水平的影響；以AnnexinV-FITC／PI染色用流式細胞儀檢測該提取物對H2O2誘導PSS患者成纖維細胞凋亡的保護作用。 [結(jié)果] 一、槌果藤乙醇提取物劑量依賴性地抑制PSS患者成纖維細胞的增殖，對正常人成纖維細胞的增殖無影響，加藥后與未加藥的成纖維細胞形態(tài)無明顯差異，凋亡、死亡細胞無明顯增多。 二、槌果藤提取物可顯著抑制PSS患者

9、成纖維細胞Ⅰ型膠原mRNA表達，并呈時間和劑量依賴性；可劑量依賴性地抑制PSS患者成纖維細胞Ⅰ型膠原蛋白的合成。 三、槌果藤提取物可顯著抑制PSS患者成纖維細胞CTGFmRNA表達，并呈時間和劑量依賴性；可劑量依賴性地抑制PSS患者成纖維細胞CTGF蛋白的表達。對TGF-βmRNA表達、蛋白合成無影響。 四、槌果藤提取物可上調(diào)PSS患者成纖維細胞MMP-1、抑制TIMP-3 mRNA表達，并呈時間和劑量依賴性。

10、五、槌果藤提取物可劑量依賴性地抑制PSS患者成纖維細胞O2-、H2O2的產(chǎn)生，劑量依賴性地降低PSS患者成纖維細胞內(nèi)ROS的水平。 六、槌果藤提取物可顯著降低H2Oz誘導的成纖維細胞凋亡。 [結(jié)論] 一、槌果藤乙醇提取物通過抑制PSS患者成纖維細胞增殖、Ⅰ型膠原基因轉(zhuǎn)錄和蛋白合成而發(fā)揮抗皮膚纖維化作用。該提取物在100 μg ml-1無明顯細胞毒性。 二、槌果藤提取物通過抑制PSS患者成纖維細胞CTGFm