槌果藤有效部位提取物軟膏在硬皮病動物模型中的抗纖維化作用研究.pdf

1、背景：
　　硬皮病是以局限性或彌漫性皮膚和內(nèi)臟器官結締組織的纖維化或硬化，最后發(fā)生萎縮為特點的疾病，可分為局限性和系統(tǒng)性兩類。目前，我國硬皮病的發(fā)病率僅次于類風濕關節(jié)炎、紅斑狼瘡而居結締組織病發(fā)病的第三位。硬皮病的確切病因及發(fā)病機理不明，目前尚無理想的治療藥物和方法，若病變累及心、肺、腎等重要臟器，預后不佳，可導致死亡。局限性硬皮病常見于額面、四肢等外露部位，嚴重影響美觀，給患者帶來不小的心理壓力。因此，如何合理、有效治療硬皮病顯

2、得十分重要。
　　硬皮病患者的成纖維細胞膠原合成增加是皮膚、內(nèi)臟纖維硬化的主要原因之一、SSc成纖維細胞合成Ⅰ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ型膠原較正常增多，其中尤以Ⅰ型膠原增多顯著。在此過程中，β-轉化生長因子(TGF-β)是刺激成纖維細胞合成Ⅰ型膠原的重要因子，能刺激成纖維細胞生成結締組織生長因子(CTGF)，后者可使成纖維細胞活化，合成膠原明顯增加。CTGF是維持纖維化所不可缺少的因子，與TGF-β共同作用主導硬皮病的纖維化病理過程。

3、　　槌果藤（Capparis spinosa L.）又稱刺山柑，具有祛風、除濕、通鼻竅、止淤消腫、止痛活血之功效;在新疆省內(nèi)作為一種民族醫(yī)藥而被廣泛應用。化學研究表明:槌果藤中含有揮發(fā)油、吲哚類、類黃酮類、谷甾醇類、葡萄糖異硫氰酸鹽及一些結構新穎的化合物。藥理學研究表明，槌果藤具有抗菌、抗炎、抗氧化、保肝、降血脂血糖等作用。體外抗氧化實驗發(fā)現(xiàn):槌果藤花蕾的甲醇冷凍提取物(LECS)的抗氧化活性很強并可呈劑量依賴性的抑制壞血酸鹽誘導的脂質(zhì)

4、過氧化。體內(nèi)抗氧化實驗研究:發(fā)現(xiàn)局部使用LECS能顯著減輕UVB誘導的皮膚紅斑。LECS可顯著抑制IL-1β引起的炎癥介質(zhì):一氧化氮、前列腺素E2及活性氧(ROS)的釋放，因此，我們推測槌果藤醇提物具明顯的抗皮膚纖維化、抗氧化作用。我們進行了一些體外實驗研究，研究發(fā)現(xiàn)槌果藤乙醇提取物可顯著抑制PSS患者Ⅰ型膠原產(chǎn)生，對正常人成纖維細胞的增殖、Ⅰ型膠原產(chǎn)生無影響，加藥后成纖維細胞形態(tài)無明顯改變，凋亡、死亡細胞無明顯增多，提示槌果藤乙醇提取

5、物具選擇性抗皮膚纖維化作用，且其抗皮膚纖維化作用明顯優(yōu)于積雪甙，并篩選出了有效部位。進一步機理研究發(fā)現(xiàn)槌果藤乙醇提取物通過抑制CTGF表達來抑制膠原合成。
　　基于以上研究，我們設計了本實驗，首先建立C3H小鼠硬皮病模型，在此基礎上我們通過觀察不同濃度槌果藤有效部位、積雪甙對小鼠模型皮膚厚度、膠原纖維組織化學指數(shù)、皮膚組織羥脯氨酸含量的影響，進一步從動物體內(nèi)證實槌果藤有效部位的在體效果及其與積雪甙的在體療效差異并篩選出最優(yōu)濃度的槌

6、果藤乙酸乙酯提取物。我們前期的課題通過提取工藝研究、配合藥效學試驗獲得便于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的有效部位，并通過外用制劑工藝、質(zhì)量標準、穩(wěn)定性研究研制出質(zhì)量穩(wěn)定的槌果藤有效部位外用制劑，本研究進行槌果藤有效部位外用制劑的在體研究，為硬皮病的治療開拓新的領域，為槌果藤的進一步開發(fā)應用提供依據(jù)。
　　目的：
　　通過槌果藤有效部位提取物軟膏在硬皮病動物模型中的在體研究，證實其抗纖維化作用并篩選出軟膏的最佳作用濃度。
　　材料和方法：

7、
　　將C3H小鼠隨機分成6組:正常對照組，空白對照組（下文中的博來霉素組），槌果藤軟膏低、中、高劑量組及陽性對照組（下文中的積雪苷組），每組9只，均剃去背部中央?yún)^(qū)被毛，面積約1.5cm*2cm。
　　背部皮下注射250μg/ml博來霉素200μl，每日一次，并于注射第一天即在注射部位外敷空白基質(zhì)、1％、2.5％、5％槌果藤軟膏、2.5％積雪甙軟膏各0.5g，每日2次，共3周;3周后取涂藥局部皮膚，經(jīng)HE、Masson三色染

8、色，測定不同濃度槌果藤軟膏組真皮厚度、膠原纖維組織化學指數(shù)、羥脯氨酸含量，并與空白基質(zhì)組、陽性對照積雪苷軟膏組比較，觀察各濃度槌果藤軟膏對皮膚纖維化指標（真皮厚度、膠原纖維組織化學指數(shù)、羥脯氨酸含量）抑制率的大小，對槌果藤軟膏抗皮膚纖維化療效進行在體驗證，并確定最佳作用濃度。
　　統(tǒng)計方法
　　SPSS20.0軟件進行分析，結果以(X)±S表示，進行正態(tài)性和方差齊性檢驗，多組間數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析，兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢

9、驗，檢驗水準取0.05.
　　結果：
　　1.皮膚厚度博來霉素組注射區(qū)皮膚真皮厚度顯著高于正常對照組(p＜0.01)，槌果藤1％、2.5％軟膏組能顯著抑制博來霉素誘導的真皮層增厚，尤其是2.5％組作用更為顯著。槌果藤5％軟膏組、積雪甙軟膏組抑制作用顯著弱于前兩者。
　　2.真皮膠原纖維組織化學指數(shù)博來霉素組的小鼠注射區(qū)皮膚真皮層膠原纖維明顯增多、增粗、排列緊密，其膠原纖維組織化學指數(shù)顯著高于正常對照組，槌果藤1％，2.

10、5％軟膏組能明顯抑制真皮層膠原沉積，該組小鼠的膠原纖維組織化學指數(shù)顯著低于博來霉素組，積雪甙軟膏對真皮層膠原沉積抑制作用顯著弱于槌果藤軟膏
　　3.皮膚組織羥脯氨酸含量博來霉素組小鼠皮膚羥脯氨酸含量顯著增高，槌果藤軟膏組小鼠皮膚羥脯氨酸含量顯著低于博來霉素組，積雪甙軟膏組小鼠皮膚羥脯氨酸含量介于槌果藤軟膏組與博來霉素組之間。
　　結論：
　　槌果藤乙酸乙酯提取物軟膏具有顯著的抗皮膚纖維化作用，其中濃度為1％、2.5％療