Th17細胞對系統(tǒng)性硬皮病患者皮膚成纖維細胞膠原合成的影響.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 SSc患者Th17和Treg細胞亞群及相關細胞因子的研究
　　目的:研究Th17和Treg細胞亞群在系統(tǒng)性硬皮病(Systemic scleroderma，SSc)患者外周血中的變化情況，觀察治療前后該細胞的變化，探討其在SSc發(fā)病中的可能作用。
　　方法:35例SSc患者和22例正常對照者用流式細胞儀檢測外周血中Th17、Treg細胞各占CD4+細胞的百分比，其中10例

2、SSc患者經(jīng)治療1月后再次流式檢測Th17、Treg細胞水平。20例SSc患者和16例正常對照者用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)方法檢測外周血清中IL-17、IL-21、IL-22的表達情況;用熒光定量PCR(real-time PCR)法檢測外周血單個核細胞(PBMC)中IL-17、IL-21、IL-22mRNA的表達情況。
　　結(jié)果:(1)SSc患者外周血中Th17細胞占CD4+細胞的百分比(1.29±0.84)，較正常人組(

3、0.57±0.24)顯著增高，有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。SSc患者外周血中Treg細胞占CD4+細胞的百分比(6.36±3.33)，較正常人組(9.15±2.91)顯著降低，差異也具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。其中10例SSc患者經(jīng)治療1月后，再次檢測Th17細胞所占百分比為(0.78±0.25)，較治療前降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。治療后Treg細胞百分比為(7.14±3.60)，與治療前比較無顯著性差異(P＞0.

4、05)。
　　(2)SSc患者和正常人血清中IL-17的濃度分別為(50.30±20.23) pg/ml和(20.48±5.69) pg/ml，兩組間比較有顯著性差異(P＜0.05)。IL-21、IL-22的濃度兩組間比較均無顯著性差異(P＞0.05)。SSc患者和正常人外周血PBMC的IL-17 mRNA表達水平分別為18.72±2.01、7.59±0.84，兩組間比較有顯著性差異(P＜0.05)。SSc患者和正常人PBMC的I

5、L-21 mRNA表達水平分別為15.99±1.50、10.83±0.97，兩組間比較有顯著性差異(P＞0.05)。IL-22 mRNA表達水平分別為23.76±3.87、24.53±4.64，兩組間比較無顯著性差異。
　　結(jié)論:SLE患者外周血中存在Th17細胞亞群的改變，可能與SSc的發(fā)病相關。
　　第二部分 SSc患者外周血PBMC對成纖維細胞高膠原合成克隆膠原合成的影響及IL-17單抗的干預作用
　　目的:分離

6、培養(yǎng)SSc患者皮膚成纖維細胞(human dermal fibroblast，HDF)克隆，篩選出高膠原合成克隆。分選SSc患者和正常人外周血PBMC，檢測其對成纖維細胞克隆的影響。
　　方法:SSc患者皮膚Fb采用組織塊法原代培養(yǎng)，改良的有限稀釋法分離Fb克隆，通過熒光定量PCR法檢測Fb克?、裥颓澳z原al鏈(COLlAl)mRNA的表達。篩選高膠原合成成纖維細胞克隆。密度梯度離心法分離SSc患者和正常人各10例外周血PBMC，

7、經(jīng)PMA、Ionomycin刺激5h后上清液與成纖維細胞克隆共培養(yǎng)。ELISA檢測上清液中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白水平變化，熒光定量PCR檢測單克隆細胞膠原mRNA合成的變化。并研究加入IL-17單抗后，膠原表達的變化。
　　結(jié)果:建立3個SSc患者皮膚Fb細胞系，經(jīng)分離、培養(yǎng)共獲得32個Fb克隆。通過聚類分析將所有克隆的CT值分為高、中、低三組，選取8個高膠原合成克隆做后續(xù)試驗。ELISA檢測與SSc患者和正常人PBMC上清液共培養(yǎng)的F

8、b克?、裥湍z原濃度分別為(186.13±30.07)ng/ml、(55.86±15.47)ng/ml，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。Ⅲ型膠原濃度分別為(156.44±35.19)ng/ml、(74.62±26.16)ng/ml，差異也具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。熒光定量PCR檢測與SSc患者和正常人PBMC上清液共培養(yǎng)的Fb克?、裥湍z原表達水平分別為12.29±1.71、6.75±1.28，兩組間比較有顯著性差異(P＜0.05

9、)。Ⅲ型膠原表達水平分別為10.94±2.34、6.22±1.50，兩組間比較也有顯著性差異(P＜0.05)。加入IL-17單抗后，Ⅰ、Ⅲ型膠原表達均有所降低。
　　結(jié)論:SSc患者的PBMC細胞培養(yǎng)上清可增加HDF克隆膠原基因的表達，參與SSc的發(fā)病過程。通過拮抗IL-17的功能可以部分阻斷SSc患者PBMC細胞的促成纖維細胞膠原合成作用，提示IL-17對SSc患者HDF膠原合成有促進作用。
　　第三部分 SSc患者Th1

10、7和Treg細胞對成纖維細胞高膠原合成克隆膠原合成的影響
　　目的:分選系統(tǒng)性硬皮病患者和正常人的外周血Th17、Treg細胞，檢測其對成纖維細胞高膠原合成克隆的影響。
　　方法:進展期SSc患者和正常對照者各5例分離外周血PBMC，流式細胞儀分選Th17、Treg細胞。分別與之前獲得的成纖維細胞高膠原合成克隆共培養(yǎng)。 ELISA方法檢測細胞培養(yǎng)上清液中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白水平變化，熒光定量PCR法檢測單克隆細胞Ⅰ、Ⅲ型膠原mR

11、NA合成的變化。
　　結(jié)果:與SSc患者和正常對照組Th17細胞共培養(yǎng)的單克隆成纖維細胞上清液中Ⅰ型膠原濃度分別為(120.29±11.53) ng/ml、(50.45±6.40)ng/ml，兩組間比較有顯著性差異(P＜0.05)。Ⅲ型膠原濃度分別為(97.63±9.88)ng/ml、(65.64±8.76)ng/ml，兩組間比較也有顯著性差異(P＜0.05)。與SSc患者和正常對照組Th17細胞共培養(yǎng)的單克隆成纖維細胞Ⅰ型膠原m

12、RNA表達水平分別為9.54±0.97、6.26±1.25，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。Ⅲ型膠原mRNA表達水平分別為8.53±1.45、5.45±2.82，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與SSc患者和正常對照組Treg細胞共培養(yǎng)的單克隆成纖維細胞Ⅰ、Ⅲ型膠原表達水平均無明顯差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:SSc患者的Th17細胞可增加成纖維細胞Ⅰ、Ⅲ型膠原基因的表達，該細胞可能在SSc發(fā)病中起一定作用。
　

13、　第四部分 IL-17對SSc患者成纖維細胞膠原合成的影響
　　目的:檢測IL-17對SSc患者皮膚成纖維細胞高膠原合成克隆膠原合成的影響，并探討其可能的機制。
　　方法:IL-17與高膠原合成HDF克隆共培養(yǎng)72h，MTT法繪制生長曲線。IL-17(20ng/ml)與HDF克隆共培養(yǎng)后，熒光定量PCR法檢測克隆細胞Ⅰ型前膠原、IL-17R及粘附分子ICAM-1 mRNA表達，并研究加入IL-17單抗(20ug/ml)后，Ⅰ

14、型膠原和相關因子表達的變化。
　　結(jié)果:成纖維細胞克隆與IL-17共培養(yǎng)組較未加IL-17組細胞增殖速度加快，細胞倍增時間縮短?？瞻捉M、與IL-17共培養(yǎng)組、與IL-17+IL-17單抗共培養(yǎng)組HDFⅠ型膠原mRNA表達水平分別為8.71±2.72、12.50±2.19、10.53±2.28，三組間比較均有顯著性差異(P＜0.05)。IL-17R mRNA表達水平分別為10.74±1.32、15.69±2.08、11.99±1.5