STBM介導樹突狀細胞免疫調節(jié)與PE發(fā)病的研究.pdf

1、目的:
　　子癇前期(PE)是一種復雜疾病，其病因及發(fā)病機制均不明，以孕20周后母體出現(xiàn)高血壓、蛋白尿等為主要特征，PE是一種影響全身小動脈的特發(fā)性疾病，能夠引起產(chǎn)婦和胎兒腦出血、昏迷和早產(chǎn)。而合體滋養(yǎng)細胞微泡(STBM)是母體釋放的胎盤源性不良因子之一。人胎盤的合體滋養(yǎng)細胞產(chǎn)生和分泌大小不同、形態(tài)和功能各異的胞外囊泡狀結構，并且參與妊娠期母胎之間的對話。STBM是合體滋養(yǎng)細胞激活或凋亡時由合體滋養(yǎng)細胞胞膜脫落下來的較大的囊泡(0

2、.2-2um)。STBM脫落的同時，合體滋養(yǎng)細胞會分泌外泌體(exosome)，只是體積更小，直徑為納米級的(30-150nm)。STBM被釋放入血后被胎盤絨毛覆蓋，并且有對應的生物學功能。STBM在母體免疫系統(tǒng)中的主要作用是促炎性免疫激活，而外泌體則能夠通過多種途徑降低母體免疫。有研究發(fā)現(xiàn)PE患者外周血中的STBM的濃度較正常的孕婦或未孕婦女高，且早發(fā)型重度子癇前期尤甚。
　　免疫-炎癥反應實際上在孕早期就存在于正常妊娠母體內，

3、但程度輕微且受嚴密調控，近年研究表明，PE發(fā)病的中心環(huán)節(jié)之一就是母胎免疫耐受失衡。妊娠是一種成功的半同種移植現(xiàn)象，既往研究表明正常妊娠時母體免疫狀態(tài)以Th2-Treg型免疫耐受為主，即維持母體的免疫耐受狀態(tài)從而保護胎兒免受母體免疫系統(tǒng)攻擊，妊娠得以繼續(xù);而PE時母體免疫狀態(tài)則以Th1-Th17型免疫激活為主，使全身系統(tǒng)性炎癥反應急劇擴大，最終引發(fā)多器官功能病變。
　　樹突狀細胞(Dendreitic cells，DCs)是體內功能

4、最為強大的專職抗原遞呈細胞，在誘導免疫耐受中發(fā)揮重要作用，但樹突狀細胞在妊娠免疫調節(jié)中扮演什么角色目前尚未完全闡明。有研究表明DCs具有誘導免疫耐受和免疫激活的雙面性，而其成熟狀態(tài)決定免疫應答的結局。成熟的DCs表達與抗原遞呈相關的組織相容性復合物(MCHⅡ)類分子、表面共刺激分子CD80、CD86等，可以誘導T細胞產(chǎn)生細胞免疫反應，從而使機體向Th1-Th17型免疫方向轉移，誘導母體系統(tǒng)性炎癥反應;而未成熟DC（immature DC

5、s，iDCs），將抗原遞呈給CD4+T細胞后不能將其激活，誘導機體向Th2-Treg方向轉移，介導胎兒抗原特異性免疫耐受狀態(tài)。有研究表明STBM具有激活粒細胞、誘導細胞免疫，調節(jié)促炎性細胞因子釋放的功能。同時STBM也可誘導單核細胞，引起TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等細胞因子釋放增強，從而調節(jié)Th1-Th17/Th2-Treg免疫失衡。而DCs與粒細胞和單核細胞具有相同的前體細胞，鑒于STBM與DCs的密切關系，我們試圖通過

6、觀察胎盤合體滋養(yǎng)細胞微泡對樹突狀細胞分化狀態(tài)的影響，初步探討STBM對樹突狀細胞表型分化、合成分泌及抗原提呈等生物學功能的調節(jié)作用，進一步明確了STBM、DCs與子癇前期發(fā)生系統(tǒng)性炎癥反應的關系。為重建PE患者免疫監(jiān)視以維持母體免疫狀態(tài)提供初步的實驗依據(jù)，為干預、阻斷孕晚期免疫失衡所致的全身系統(tǒng)性炎癥反應這一病理過程奠定基礎。
　　方法:
　　第一部分:子癇前期患者胎盤組織中樹突狀細胞的分子表達及分布特點
　　1.嚴格

7、按照納入標準和排除標準選取第三軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院（大坪醫(yī)院）產(chǎn)科2014年01月-2015年9月間收治的子癇前期患者（PE組）17例和正常晚孕患者（control組）20例，均取擇期剖宮產(chǎn)術后的胎盤組織。
　　2.HE染色觀察正常妊娠胎盤組織與子癇前期患者胎盤組織的絨毛和血管的差異;
　　3.免疫組化方法檢測正常妊娠胎盤組織與子癇前期患者胎盤組織DCs的分布狀態(tài)、部位以及數(shù)量差異性;
　　結果:
　　1.HE染

8、色可見PE患者胎盤組織中血管腔較正常晚孕對照組的小，且血管閉塞，絨毛血液明顯灌注不足。
　　2.免疫組化結果可見子癇前期患者胎盤組織中CD1a+DCs的數(shù)量較正常晚孕期組少(P＜0.05)。
　　3.免疫組化結果可見子癇前期患者胎盤組織中CD83+DCs的數(shù)量較正常晚孕期組多（P＜0.05）。多(P＜0.05)。
　　第二部分:小鼠合體滋養(yǎng)細胞微泡(STBM)對樹突狀細胞(DCs)分化及免疫功能的影響
　　方法:

9、
　　1.機械法和差速離心法制備小鼠合體滋養(yǎng)細胞微泡(STBM):8周齡C57BL/6小鼠，于妊娠第18天戊巴比妥麻醉后，無菌條件下剪開小鼠串珠樣子宮取出胎盤，放入消毒后的冰磷酸鹽緩沖液(PBS)中反復沖洗，直至PBS中無殘留血液和蛻膜，無菌紗布吸干水分后稱重，無菌眼科剪將胎盤剪碎（約1mm3），按2.5g/100mL的比例加入NaCl溶液（1％青-鏈霉素），4℃振蕩過夜，次日取上清離心:1500g，10min，取上清;10000

10、g，60min，取上清;100000g，60min，取沉淀;4℃的PBS（含5％蔗糖）重懸。
　　2.制備小鼠樹突狀細胞(DCs):無菌條件下取6周齡雌性C57BL/6小鼠的股骨、脛骨，用紅細胞裂解液裂解紅細胞后，應用重組鼠粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（Recombinant mouse gramulocyre-macrophage，rmGM-CSF）和重組鼠白介素4（Recombinant mouse Interleukin-4

11、，rmIL-4）進行體外誘導培養(yǎng)DCs，DCs分組如下:A組:陰性對照組:DCs+PBS;B組:DCs+STBM(1.0μg/mL);C組:DCs+STBM(1.5μg/mL);D組:DCs+STBM(2.0μg/mL);E組:DCs+STBM(2.5μg/mL);F組:DCs+LPS(2.0μg/mL)。
　　3.透射電子顯微鏡觀察鑒定STBM。將STBM稀釋40倍，滴液法制片，待樣品干燥后上機觀察。
　　4.免疫熒光方法

12、鑒定檢測小鼠樹突狀細胞。
　　5.通過流式細胞學技術(Flow CytoMetry，F(xiàn)CM)檢測各組DCs表達CD11c和CD86的變化。
　　6.應用蛋白印跡法(Western Blot)檢測各組DCs表達CD80和CD86的變化。
　　7.應用酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA法）檢測DCs分泌TNF-α、IFN-γ、IL-12的水平。
　　結

13、果:
　　小鼠合體滋養(yǎng)細胞微泡(STBM)對樹突狀細胞表型及免疫功能的影響
　　1.STBM的形態(tài)學觀察:掃描電子顯微鏡下可見STBM為雙層膜囊泡狀結構，Image-Pro Plus6.0軟件測得STBM囊泡狀的直徑為0.647μm-1.438μm，平均值為(1.025±0.236)μm。
　　2.免疫熒光可見培養(yǎng)至第5天簇集成團落狀的樹突狀細胞。
　　3.STBM刺激DCs后其表型分化:以不同濃度的STBM(1

14、.0μg/mL、1.5μg/mL、2.0μg/mL、2.5μg/mL)作用于GM-CSF誘導培養(yǎng)小鼠骨髓DCs，流式細胞學技術檢測不同處理組細胞表面分子CD11c的表達水平無明顯差異性（P＞0.05）;而各組細胞CD86表達水平隨STBM濃度的升高而增加。濃度分別為1.0μg/mL、1.5μg/mL、2.0μg/mL、2.5μg/mL的STBM，其CD11c/CD86雙陽性表達率分別為46.1±3.5％，56.9±2.8％，60.5±3

15、.2％，88.9±3.0％，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　4.Western Blot法檢測不同濃度STBM刺激DCs后，DCs表達CD80、CD86蛋白量隨著STBM濃度的增高而逐漸增多，CD80、CD86是小鼠成熟DCs的特異性分子，其蛋白量表達越多，表明成熟DCs的數(shù)量越多。由圖可看出，STBM1.5μg/mL、STBM2.0μg/mL、STBM2.5μg/mL組與PBS（control組）比較，差異有統(tǒng)計學意義（

16、P＜0.05）。
　　5.分泌TNF-α的水平:不同濃度的STBM(STBM1.0μg/mL、2.0μg/mL、4.0μg/mL、6.0μg/mL)刺激DCs，其誘導DCs產(chǎn)生的TNF-α的濃度分別為(6.91±1.37)pg/mL、(7.98±1.55)pg/mL、(9.40±0.93)pg/mL、(12.65±1.62)pg/mL，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　分泌IFN-γ的水平:不同濃度的STBM(STBM

17、2.0μg/mL、4.0μg/mL)刺激DCs，其誘導DCs產(chǎn)生的IFN-γ的濃度分別為(12.14±1.39)pg/mL、(17.52±1.67)pg/mL，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　分泌IL-12的水平:不同濃度的STBM(STBM2.0μg/mL、4.0μg/mL、6.0μg/mL)刺激DCs，其誘導DCs產(chǎn)生IL-12的濃度分別為(6.98±1.19)ng/L、(7.88±0.10)ng/L、(9.18±1.