肺常規(guī)樹突狀細胞介導的免疫反應在急性肺損傷中的作用研究.pdf

1、第一部分脂多糖誘導急性肺損傷小鼠肺、血和脾常規(guī)樹突狀細胞動態(tài)變化及與肺損傷關系研究
　　 目的：探討脂多糖(LPS)誘導急性肺損傷(ALI)小鼠肺、血和脾臟常規(guī)樹突狀細胞(cDC)動態(tài)分布規(guī)律及肺cDC與肺部炎癥損傷關系。方法C57BL/6小鼠36只，隨機分為2組:①對照組(Con):小鼠氣管內注射PBS30μl;②ALI組(ALI):氣管內注射LPS(2mg/kg)。分別在LPS或PBS注射6h、12h和24h處死。光鏡觀察肺

2、組織病理改變，測定肺損傷評分，計算肺濕重/體重比(LW/BW)，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測肺組織勻漿中白細胞介素(IL)-6的含量，以反映肺組織炎癥損傷程度。流式細胞術(FCM)測定肺、外周血和脾單細胞懸液中cDC比例及功能狀態(tài)。結果ALI組小鼠6h、12h和24h肺LW/BW均明顯高于對照組(P＜0.05)。病理檢測示ALI組小鼠肺泡間隔增寬、充血、出血及大量炎性細胞浸潤等急性肺損傷病理改變。ALI組肺損傷評分及肺組織IL-6水

3、平均顯著高于對照組(P＜0.05)。FCM檢測顯示ALI組小鼠早期(6h)肺組織cDC即快速聚集，24h達到(2.86±0.55)％，均明顯高于對照組(P＜0.05)。與對照組外周血cDC相比，ALI組6h外周血cDC明顯減少至(0.32±0.10)％，12h恢復至基線水平，24h顯著升高至(2.20±0.42)％(P＜0.05vsCon)。ALI組小鼠脾臟cDC呈一過性升高，ALI組12h脾臟cDC升高至(1.92±0.25)％(P＜

4、0.05vsCon)，24h降至基線水平(0.96±0.21)％。在各觀察時間點，ALI組表達CD80的肺cDC顯著增加(P＜0.05vsCon)，表達MHCⅡ的cDC呈升高趨勢，但未達到顯著差異(P＞0.05);ALI組小鼠12h表達MHCⅡ的外周血cDC增加(P＜0.05vsCon);與對照組相比，ALI組脾臟表達CD80的cDC顯著增加(P＜0.05vsCon)，但表達MHCⅡ無顯著差異(P＞0.05)。相關分析顯示，在各觀察時間

5、點，ALI組肺組織cDC和表達CD80的肺cDC與肺組織中IL-6呈顯著正相關，ALI組6h和12h表達MHCⅡ的肺cDC與肺組織中IL-6呈弱正相關關系。結論ALI早期肺、循環(huán)和脾臟cDC存在不同的動態(tài)規(guī)律性變化。肺cDC數(shù)量及功能狀態(tài)與肺炎癥損傷存在密切關系，肺cDC可能介導ALI病程中免疫炎癥激活過程。
　　 第二部分急性肺損傷防治新途徑:氯沙坦抑制肺常規(guī)樹突狀細胞成熟和Th1及Th17型效應
　　 目的：探討氯沙

6、坦對脂多糖(LPS)誘導的急性肺損傷(ALI)小鼠肺部炎癥的保護性效應及對肺常規(guī)樹突狀細胞(cDC)功能狀態(tài)、輔助性T細胞(Th)免疫效應的影響。方法C57BL/6小鼠隨機分為:①對照組(Con):氣管內注射與LPS等體積的PBS，氣管內注射PBS前30min，予以腹腔內注射等體積PBS;②ALI組(ALI):氣管內注射LPS2mg/kg復制ALI模型，氣管內注射LPS前30min，予以腹腔內注射等體積PBS;③ALI+氯沙坦組(Los

7、):氣管內注射LPS2mg/kg前30min，予以腹腔內注射氯沙坦15mg/kg。分別在LPS或PBS注射6、24和48h處死。光鏡觀察肺組織病理改變，計算肺損傷評分并測定肺組織肺濕/體重比(LW/BW)。流式細胞術(FCM)測定肺單細胞懸液中cDC比例及功能狀態(tài)。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定肺組織勻漿中白細胞介素(IL)-6的含量反映肺組織炎癥損傷程度。實時定量逆轉錄-聚合酶鏈反應(RealtimeRT-PCR)檢測肺組織T-be

8、t、GATA-3和RORγtmRNA表達水平，ELISA測定肺組織中IFN-γ、IL-4和IL-17的含量反映肺組織Th平衡狀態(tài)。結果ALI組小鼠24h和48h肺LW/BW明顯高于對照組相應時間點肺LW/BW(P＜0.05)。應用氯沙坦(ALI+氯沙坦組)可使肺組織LW/BW較ALI組明顯下降，但仍顯著高于對照組水平(P＜0.05)。LPS誘導ALI肺組織病理檢查見肺泡間隔增寬、肺泡間質內血管充血、出血及大量炎細胞滲出，應用氯沙坦使AL

9、I小鼠肺組織病理損傷明顯減輕，肺損傷評分顯著降低(P＜0.05)。ALI組24h和48h肺組織IL-6明顯高于對照組，應用氯沙坦組可使ALI小鼠肺組織IL-6水平明顯下降，但仍明顯高于對照組(P＜0.05)。ALI組6h肺組織cDC比例顯著升高，表達CD80的肺cDC明顯增加，ALI+氯沙坦組表達CD80的肺cDC較ALI組明顯下降，但仍顯著高于對照組水平;ALI組和氯沙坦組表達MHCⅡ的cDC無明顯差異(P＞0.05)。LPS刺激可導

10、致小鼠肺T-bet和RORγtmRNA表達水平明顯升高，且IFN-γ、IL-4和IL-17的含量顯著升高。應用氯沙坦可使肺組織中T-bet和RORγtmRNA表達明顯下降(P＜0.05)，IFN-γ和IL-17的含量明顯降低，但對IL-4水平無明顯影響(P＞0.05)。結論ALI時，肺大量成熟cDC聚集和Th1及Th17型極化免疫反應可能參與ALI病程中的免疫失衡。氯沙坦可能通過抑制肺cDC成熟和Th1及Th17型極化反應而對ALI具抗