肺常規(guī)樹(shù)突狀細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在急性肺損傷中的作用研究.pdf

1、第一部分脂多糖誘導(dǎo)急性肺損傷小鼠肺、血和脾常規(guī)樹(shù)突狀細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化及與肺損傷關(guān)系研究
　　 目的：探討脂多糖(LPS)誘導(dǎo)急性肺損傷(ALI)小鼠肺、血和脾臟常規(guī)樹(shù)突狀細(xì)胞(cDC)動(dòng)態(tài)分布規(guī)律及肺cDC與肺部炎癥損傷關(guān)系。方法C57BL/6小鼠36只，隨機(jī)分為2組:①對(duì)照組(Con):小鼠氣管內(nèi)注射PBS30μl;②ALI組(ALI):氣管內(nèi)注射LPS(2mg/kg)。分別在LPS或PBS注射6h、12h和24h處死。光鏡觀察肺

2、組織病理改變，測(cè)定肺損傷評(píng)分，計(jì)算肺濕重/體重比(LW/BW)，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)肺組織勻漿中白細(xì)胞介素(IL)-6的含量，以反映肺組織炎癥損傷程度。流式細(xì)胞術(shù)(FCM)測(cè)定肺、外周血和脾單細(xì)胞懸液中cDC比例及功能狀態(tài)。結(jié)果ALI組小鼠6h、12h和24h肺LW/BW均明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。病理檢測(cè)示ALI組小鼠肺泡間隔增寬、充血、出血及大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等急性肺損傷病理改變。ALI組肺損傷評(píng)分及肺組織IL-6水

3、平均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。FCM檢測(cè)顯示ALI組小鼠早期(6h)肺組織cDC即快速聚集，24h達(dá)到(2.86±0.55)％，均明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。與對(duì)照組外周血cDC相比，ALI組6h外周血cDC明顯減少至(0.32±0.10)％，12h恢復(fù)至基線水平，24h顯著升高至(2.20±0.42)％(P＜0.05vsCon)。ALI組小鼠脾臟cDC呈一過(guò)性升高，ALI組12h脾臟cDC升高至(1.92±0.25)％(P＜

4、0.05vsCon)，24h降至基線水平(0.96±0.21)％。在各觀察時(shí)間點(diǎn)，ALI組表達(dá)CD80的肺cDC顯著增加(P＜0.05vsCon)，表達(dá)MHCⅡ的cDC呈升高趨勢(shì)，但未達(dá)到顯著差異(P＞0.05);ALI組小鼠12h表達(dá)MHCⅡ的外周血cDC增加(P＜0.05vsCon);與對(duì)照組相比，ALI組脾臟表達(dá)CD80的cDC顯著增加(P＜0.05vsCon)，但表達(dá)MHCⅡ無(wú)顯著差異(P＞0.05)。相關(guān)分析顯示，在各觀察時(shí)間

5、點(diǎn)，ALI組肺組織cDC和表達(dá)CD80的肺cDC與肺組織中IL-6呈顯著正相關(guān)，ALI組6h和12h表達(dá)MHCⅡ的肺cDC與肺組織中IL-6呈弱正相關(guān)關(guān)系。結(jié)論ALI早期肺、循環(huán)和脾臟cDC存在不同的動(dòng)態(tài)規(guī)律性變化。肺cDC數(shù)量及功能狀態(tài)與肺炎癥損傷存在密切關(guān)系，肺cDC可能介導(dǎo)ALI病程中免疫炎癥激活過(guò)程。
　　 第二部分急性肺損傷防治新途徑:氯沙坦抑制肺常規(guī)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟和Th1及Th17型效應(yīng)
　　 目的：探討氯沙

6、坦對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的急性肺損傷(ALI)小鼠肺部炎癥的保護(hù)性效應(yīng)及對(duì)肺常規(guī)樹(shù)突狀細(xì)胞(cDC)功能狀態(tài)、輔助性T細(xì)胞(Th)免疫效應(yīng)的影響。方法C57BL/6小鼠隨機(jī)分為:①對(duì)照組(Con):氣管內(nèi)注射與LPS等體積的PBS，氣管內(nèi)注射PBS前30min，予以腹腔內(nèi)注射等體積PBS;②ALI組(ALI):氣管內(nèi)注射LPS2mg/kg復(fù)制ALI模型，氣管內(nèi)注射LPS前30min，予以腹腔內(nèi)注射等體積PBS;③ALI+氯沙坦組(Los

7、):氣管內(nèi)注射LPS2mg/kg前30min，予以腹腔內(nèi)注射氯沙坦15mg/kg。分別在LPS或PBS注射6、24和48h處死。光鏡觀察肺組織病理改變，計(jì)算肺損傷評(píng)分并測(cè)定肺組織肺濕/體重比(LW/BW)。流式細(xì)胞術(shù)(FCM)測(cè)定肺單細(xì)胞懸液中cDC比例及功能狀態(tài)。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定肺組織勻漿中白細(xì)胞介素(IL)-6的含量反映肺組織炎癥損傷程度。實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RealtimeRT-PCR)檢測(cè)肺組織T-be

8、t、GATA-3和RORγtmRNA表達(dá)水平，ELISA測(cè)定肺組織中IFN-γ、IL-4和IL-17的含量反映肺組織Th平衡狀態(tài)。結(jié)果ALI組小鼠24h和48h肺LW/BW明顯高于對(duì)照組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)肺LW/BW(P＜0.05)。應(yīng)用氯沙坦(ALI+氯沙坦組)可使肺組織LW/BW較ALI組明顯下降，但仍顯著高于對(duì)照組水平(P＜0.05)。LPS誘導(dǎo)ALI肺組織病理檢查見(jiàn)肺泡間隔增寬、肺泡間質(zhì)內(nèi)血管充血、出血及大量炎細(xì)胞滲出，應(yīng)用氯沙坦使AL

9、I小鼠肺組織病理?yè)p傷明顯減輕，肺損傷評(píng)分顯著降低(P＜0.05)。ALI組24h和48h肺組織IL-6明顯高于對(duì)照組，應(yīng)用氯沙坦組可使ALI小鼠肺組織IL-6水平明顯下降，但仍明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。ALI組6h肺組織cDC比例顯著升高，表達(dá)CD80的肺cDC明顯增加，ALI+氯沙坦組表達(dá)CD80的肺cDC較ALI組明顯下降，但仍顯著高于對(duì)照組水平;ALI組和氯沙坦組表達(dá)MHCⅡ的cDC無(wú)明顯差異(P＞0.05)。LPS刺激可導(dǎo)

10、致小鼠肺T-bet和RORγtmRNA表達(dá)水平明顯升高，且IFN-γ、IL-4和IL-17的含量顯著升高。應(yīng)用氯沙坦可使肺組織中T-bet和RORγtmRNA表達(dá)明顯下降(P＜0.05)，IFN-γ和IL-17的含量明顯降低，但對(duì)IL-4水平無(wú)明顯影響(P＞0.05)。結(jié)論ALI時(shí)，肺大量成熟cDC聚集和Th1及Th17型極化免疫反應(yīng)可能參與ALI病程中的免疫失衡。氯沙坦可能通過(guò)抑制肺cDC成熟和Th1及Th17型極化反應(yīng)而對(duì)ALI具抗