結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白的表達、免疫特性分析及在牛結(jié)核病檢測中的初步應(yīng)用.pdf

1、結(jié)核病(Tuberculosis,TB)主要是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)復(fù)合物引起的一類以呼吸系統(tǒng)感染為主的慢性人獸共患傳染病病。該復(fù)合物主要成員包括主要引起人TB的MTB以及引起牛結(jié)核病的牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis,M.bovis)。上世紀(jì)80年代以來,由于人口增長、移民、HIV共感染及耐藥強毒株廣泛傳播等因素的影響,TB在世界范圍內(nèi)再次流行。估計全球有20億

2、人感染,活動性肺結(jié)核病人2000余萬,且每年新增800-900萬TB病例,死亡200萬人左右。牛結(jié)核病不僅嚴(yán)重影響?zhàn)B牛業(yè)的健康發(fā)展,同樣也會導(dǎo)致部分人TB的發(fā)生。作為主要疾病負(fù)擔(dān)和致死因素之一,TB日益成為嚴(yán)重的全球性公共衛(wèi)生問題并引起國際社會的廣泛關(guān)注。
　　 TB防控需要有效的疫苗和特異性診斷試劑?？ń槊?BCG)作為人類唯一使用的抗TB疫苗在兒童TB和彌散性TB中效果良好,但對成人肺結(jié)核保護效果不佳(0-80％),且BCG

3、免疫會干擾TB的皮試診斷。因此,鑒定病原特異性的抗原對發(fā)展新型抗TB保護性疫苗和特異性診斷試劑顯得尤為必要。比較基因組學(xué)等的發(fā)展提供了大量特異性抗原信息,它們的免疫特性評價常用于鑒定新型抗TB疫苗候選抗原和診斷試劑。本研究應(yīng)用原核系統(tǒng)表達和純化了7種結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白,對其中5種重組蛋白進行了免疫特性分析,同時利用間接ELISA方法,評價和比較其在牛結(jié)核病血清學(xué)診斷中的潛能。
　　 1.結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白的表達和鑒定

4、　　 參考比較基因組學(xué)信息,選取6種MTB抗原蛋白(MPT64、MPT63、MPT83、CFP32、MPT51和MPT53),首先通過PCR擴增相應(yīng)的編碼基因序列,經(jīng)克隆篩選和測序鑒定正確后,利用pET30a質(zhì)粒構(gòu)建原核表達載體。將鑒定正確的重組表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),篩選獲得陽性轉(zhuǎn)化子,再以IPTG誘導(dǎo)表達,對以胞內(nèi)可溶性表達的上述6種抗原蛋白及ESAT-CFP10融合蛋白(本室保存)進行親和層析純化。定量測定和分析

5、純化產(chǎn)物濃度和純度,并通過Western blotting試驗分析融合蛋白的免疫原性。
　　 SDS-PAGE結(jié)果顯示誘導(dǎo)后各目的蛋白均成功表達,且主要以可溶形式存在,灰度分析顯示各目的蛋白表達量約占裂解上清總蛋白的30％左右(分別為34.8％、32.7％、27.4％、27.8％、30.6％、31.5％和30.2％),而純化后融合蛋白的純度,除MPT53(69.8％)外其余均在90％以上(其中MPT64為92.7％、MPT63為

6、95.6％、MPT83為96.6％、CFP32為91.8％、MPT51為92.3％、ESAT-6-CFP10為96.6％)。Western blotting結(jié)果顯示,在各融合蛋白處均出現(xiàn)特異性目的條帶,表明其具有較好的免疫反應(yīng)性。
　　 2.五種融合蛋白的細胞免疫學(xué)特性分析
　　 以ESAT-CFP10、MPT64、MPT63、MPT83、CFP32五種融合蛋白分別皮下免疫C57BL/6小鼠,二免兩周后取脾臟淋巴細胞進行

7、免疫學(xué)測定。將淋巴細胞直接標(biāo)記PE-CD4/CD69-FITC和APC-CD8α/CD69-FITC利用流式細胞術(shù)檢測CD4+和CD8+T細胞表面CD69的表達,結(jié)果顯示五種蛋白均能引起兩類淋巴細胞亞群CD69表達量上調(diào),且MPT63和ESAT-6-CFP10刺激CD4+細胞表達CD69的能力顯著高于其他幾種蛋白。利用ELISPOT試驗分析五種蛋白作刺激劑活化淋巴細胞分泌IFN-γ和IL-4能力,結(jié)果顯示ESAT-6-CFP10與MPT

8、63刺激細胞產(chǎn)生IFN-γ的能力最強,ESAT-6-CFP10和CFP32刺激細胞產(chǎn)生IL-4的能力最強,而MPT64刺激細胞產(chǎn)生IFN-γ和IL-4的能力在所有蛋白中最弱。比較同一種蛋白活化特異淋巴細胞產(chǎn)生IFN-γ和IL-4的能力,結(jié)果顯示ESAT-6-CFP10和MPT63蛋白刺激細胞分泌IFN-γ的能力顯著大于IL-4,呈Th1免疫應(yīng)答趨勢;MPT83和MPT64蛋白則相反,呈Th2免疫應(yīng)答趨勢:而CFP32蛋白刺激細胞分泌兩種

9、細胞因子的能力相當(dāng),呈現(xiàn)Th1/Th2免疫平衡趨勢。同時,通過夾心ELISA方法對各融合蛋白刺激后的細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ和IL-4含量進行定量分析,也得到與ELISPOT試驗相似的結(jié)果。
　　 3.五種融合蛋白的牛結(jié)核診斷價值評價
　　 在淋巴細胞增殖試驗中,以ESAT-CFP10、MPT64、MPT63、MPT83、CFP32五種融合蛋白作為刺激原,與PPD同步刺激臨床采集的25份奶牛尾靜脈血,再用IFN-γ試劑盒

10、檢測其活化抗原特異性細胞產(chǎn)生IFN-γ的水平。均值和線性回歸分析的結(jié)果顯示5種蛋白中ESAT-6-CFP10刺激IFN-γ的產(chǎn)生與Bovine PPD的相關(guān)性最高,MPT63蛋白的相關(guān)性次之。以0.280作為蛋白刺激陽性反應(yīng)的切割值,其陽性率與試劑盒陽性符合率由高到低依次為ESAT-6-CFP10、MPT63、MPT83、MPT64和CFP32。
　　 同時以上述5種蛋白作為包被抗原,建立間接ELISA方法,通過檢測臨床牛血漿上

11、清中特異性抗體以評價它們用于牛結(jié)核血清學(xué)診斷的潛在應(yīng)用價值。各蛋白的陽性檢出率如下:MPT64為8.40％(20/238),MPT63為9.66％(23/238),MPT83為17.65％(42/238),CFP32為11.34％(27/238),ESAT-6-CFP10為2.52％(6/238),顯示MPT83和CFP32血清學(xué)檢測的敏感性較高。將各蛋白的間接ELISA結(jié)果與IFN-γ試劑盒的結(jié)果進行比較,結(jié)果顯示兩種方法的陰性符合率