黑骨藤抗炎作用及質(zhì)量控制研究.pdf

1、黑骨藤藥材屬于蘿藦科植物中杠柳屬——黑龍骨Periploca forrestii Schltr.的干燥根或全株，民間廣為流傳的優(yōu)質(zhì)中藥材。主要功效為通經(jīng)、活血、解毒、祛風，常用于治療跌打損傷、風濕、關節(jié)痛、月經(jīng)不調(diào)等病癥，以其為主藥的上市品種黑骨藤追風活絡膠囊、楓荷除痹酊、復方仙靈風濕酒、生龍驅(qū)風藥酒等，在臨床上發(fā)揮了較好的治療作用。黑骨藤主要的化學成分包括甾體苷、強心苷、低聚糖、香豆素、黃酮、三萜類，藥理實驗證明其具有抗癌、抗炎、鎮(zhèn)痛

2、、強心、免疫抑制及抗氧化等作用，但其抗炎的有效組分及作用機制還有待進一步研究。且該藥材現(xiàn)行標準中僅記載了其性狀和理化鑒別，這在一定程度上限制了黑骨藤藥材的應用，同時也說明黑骨藤藥材在質(zhì)量控制方面有待完善?；诖?，本研究對黑骨藤抗炎有效組分進行篩選、體內(nèi)抗炎作用、作用機制、化學成分分析以及質(zhì)量標準進行了研究，為闡明黑骨藤的抗炎作用機理提供了理論基礎，為藥材質(zhì)量標準的制訂與臨床應用提供了科學依據(jù)。
　　1.采用脂多糖(LPS)誘導的R

3、AW264.7細胞體外炎癥模型,對黑骨藤水組分（WFPF）、10％乙醇組分（EFPF）、50%乙醇組分（50%EFPF）、95%乙醇組分（95%EFPF）進行抗炎活性篩選，明確其抗炎的有效組分。采用MTT法檢測細胞存活率、Griess試劑法檢測細胞上清液中一氧化氮(NO)含量、酶聯(lián)免疫法(ELISA）法檢測細胞上清液中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的含量，考察了黑骨藤不同組分的抗炎活性。實驗結果顯示黑骨藤中EFPF抑制LPS誘導的RAW

4、264.7細胞釋放NO和TNF-α的作用較優(yōu)，表明EFPF為黑骨藤抗炎的有效組分。
　　2.采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC-Q-TOF-MS）聯(lián)用的技術對黑骨藤抗炎有效組分EFPF中的主要化學成分進行表征，通過對各色譜峰的保留時間、分子量、分子式、紫外吸收、二級質(zhì)譜等信息進行分析，并結合對照品和文獻比對，對有效組分中的8個主要化學成分峰進行了表征。化學成分分析表明，EFPF中主要含有1-O-咖啡?；鼘幩?

5、1-CQA)、3-O-咖啡酰基奎寧酸(3-CQA)、5-O-咖啡?；鼘幩?、4-O-咖啡?；鼘幩帷?-O-咖啡?；鼘幩?、1-O-咖啡?；鼘幩嵋阴?、3-O-咖啡?；鼘幩嵋阴?、4-O-咖啡?；鼘幩嵋阴?4-CDOA)等各種咖啡?；鼘幩犷惢衔?，為進一步闡釋其藥效物質(zhì)基礎提供了依據(jù)。
　　3.采用醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性增高、二甲苯致小鼠耳腫脹和角叉菜膠致大鼠足趾腫脹的動物體內(nèi)炎癥模型,對篩選得到的黑骨藤抗炎有效組分EF

6、PF進行了體內(nèi)抗炎藥效研究。結果顯示，EFPF能顯著降低小鼠腹腔毛細血管通透性、二甲苯誘導的小鼠耳廓腫脹和角叉菜膠誘導的大鼠足趾腫脹。提示EFPF具有較好的體內(nèi)抗炎活性。
　　4.進一步研究EFPF對RAW264.7細胞凋亡、炎癥介質(zhì)和炎癥因子分泌、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)和環(huán)氧合酶2(COX-2)等相關調(diào)控蛋白表達的影響以及核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信號通路的情況，探討 EFPF的抗炎

7、作用機制。采用 AO/EB染色法和流式細胞技術檢測EFPF對LPS誘導的RAW264.7細胞形態(tài)變化、凋亡率、活性氧（ROS）和線粒體膜電位(MMP)影響；采用 Griess試劑法測定 RAW264.7細胞中 NO的含量；采用 ELISA法檢測細胞上清液中前列腺素 E2(PGE2)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素6(IL-6)和白介素10(IL-10)的分泌水平；應用熒光定量 PCR技術（RT-PCR）測定RAW264.7分泌細

8、胞因子（TNF-α、IL-6、IL-10）mRNA表達的情況；采用免疫印跡法(Western blot)檢測iNOS和COX-2蛋白表達以及NF-κB、MAPKs(細胞外信號調(diào)節(jié)激酶-ERK、C-jun氨其未端激酶-JNK、p38絲裂原活化蛋白激酶-p38 MAPK)信號通路相關調(diào)控蛋白的表達。實驗結果顯示，與 LPS模型組相比，EFPF劑量顯著降低LPS誘導的 RAW264.7細胞凋亡率、ROS的含量和MMP（P<0.05,P<0.0

9、05,P<0.001）；顯著抑制LPS誘導的 RAW264.7細胞中炎癥介質(zhì)NO、PGE2(P<0.05)和炎癥因子TNF-α、IL-6的分泌(P<0.05)，增加IL-10的產(chǎn)生(P<0.05)；顯著抑制TNF-a、IL-6和提高IL-10的mRNA表達量(P<0.005,P<0.001)；顯著抑制細胞中 iNOS和 COX-2的蛋白表達(P<0.05,P<0.001)，降低 NF-κB信號通路中 p-IκBα和 p65蛋白的表達(P

10、<0.05, P<0.001)，抑制 IκBα蛋白降解(P<0.05,P<0.001)；并抑制 MAPKs信號通路中p38、ERK1/2和JNK的磷酸化(P<0.05,P<0.005)。結果表明EFPF主要通過抑制細胞凋亡，ROS的過量產(chǎn)生及穩(wěn)定MMP、調(diào)控NF-κB和MAPKs信號通路來降低TNF-α, IL-6, NO和 PGE2等炎癥因子的產(chǎn)生以及抑制iNOS和COX-2蛋白表達，從而發(fā)揮EFPF的抗炎作用。
　　5.通過對