巴斯德畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)重組人溶菌酶的研究.pdf

1、本文對含人溶菌酶基因的PichiaPastorisGS115的發(fā)酵條件進行了研究，通過考察酵母生長規(guī)律，工業(yè)培養(yǎng)基中碳源、氮源的組成對酵母生長的影響以及不同誘導(dǎo)時間、不同誘導(dǎo)pH值、混合碳源對蛋白得率的影響得出了優(yōu)化的發(fā)酵條件：酵母在培養(yǎng)36h后(即甘油耗盡1-2h后)，結(jié)束生長階段，開始加入甲醇進行誘導(dǎo)表達；誘導(dǎo)總時間維持在72-84h(即3天到3.5天)目標(biāo)蛋白收率較大；誘導(dǎo)期間采用混合碳源，有利于維持畢赤酵母在工業(yè)培養(yǎng)基的正常生長

2、和代謝，有利于提高發(fā)酵密度，也有利于提高目標(biāo)蛋白的表達量；當(dāng)將傳統(tǒng)工業(yè)培養(yǎng)基中碳源和氮源的質(zhì)量濃度分別降低至35g/L和5g/L時，酵母生長期的細胞密度與傳統(tǒng)培養(yǎng)基相差不大，但培養(yǎng)時間可減少4h，節(jié)省了生產(chǎn)成本；維持誘導(dǎo)期間的pH=4.0對目標(biāo)蛋白的表達最有利。 本文還對目標(biāo)蛋白的分離純化進行了研究，通過對不同層析柱分離效果的比較，優(yōu)化了分離純化方法：采用將SPFF強陽離子與DEAE弱陰離子交換層析柱偶聯(lián)的分離方法，達到進一步除

3、雜，并濃縮目標(biāo)蛋白的作用，目標(biāo)蛋白產(chǎn)量約為50mg/L。對于SPFF強陽離子交換層析柱，采用Na2HPO4-NaH2PO4(CNa+=50mM)，pH7.0緩沖體系，同時洗脫緩沖體系維持NaCl濃度為0.4M時分離效果較好；對于DEAE弱陰離子交換層析柱，采用Tris-HCl(Ccl-=20mM)，pH8.0緩沖體系，同時洗脫緩沖體系也維持NaCl濃度為0.4M時濃縮效果較好。 本文最后對酶切方法與活性檢測方法進行了簡單研究，發(fā)