畢赤酵母生產(chǎn)重組人白介素11的發(fā)酵工藝研究.pdf

1、本文首先通過(guò)搖瓶實(shí)驗(yàn)對(duì)巴斯德畢赤酵母高效表達(dá)重組人白介素11的發(fā)酵條件、防止表達(dá)產(chǎn)物降解和聚合等方面進(jìn)行了優(yōu)化;根據(jù)優(yōu)化的結(jié)果進(jìn)行了補(bǔ)料分批發(fā)酵和放大，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了鑒定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.考察了影響外源蛋白表達(dá)的因素，對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到最佳培養(yǎng)及誘導(dǎo)條件為:接種量為10％，最佳種齡菌體密度OD600在10到20之間，誘導(dǎo)菌體密度OD600在120-150，誘導(dǎo)時(shí)間為70小時(shí)，甲醇濃度為0.5％，pH誘導(dǎo)前為6.

2、0，誘導(dǎo)后為6.8，發(fā)酵溫度為誘導(dǎo)前30攝氏度，誘導(dǎo)后降為25攝氏度，誘導(dǎo)48小時(shí)后降為22攝氏度。
　　2.實(shí)現(xiàn)對(duì)外源蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化，減少目的蛋白的降解和聚合。對(duì)小罐試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行了放大，用德國(guó)貝朗公司D100型150L發(fā)酵罐進(jìn)行了補(bǔ)料，分批發(fā)酵。最佳的實(shí)驗(yàn)條件為:
　　甘油培養(yǎng)階段:甘油濃度為40g/L，培養(yǎng)溫度為30℃，pH6.0，溶氧40％。甘油流加階段:等第一階段甘油耗盡（溶氧突然躍升）即可進(jìn)行甘油流加，50％

3、甘油(含12ml/L PTMl)以24mL/L/h的速率進(jìn)行補(bǔ)加，約4小時(shí)后，OD600大概在120-150左右，停止補(bǔ)加。
　　甲醇流加階段:等第二階段結(jié)束后，饑餓半小時(shí)左右。等溶氧和pH均明顯上升后，添加0.5％濃度的甲醇，待甲醇流量檢測(cè)器讀數(shù)穩(wěn)定后，以該讀數(shù)值為控制點(diǎn)進(jìn)行100％甲醇（含12ml/L PTMl）反饋流加。誘導(dǎo)初期添加1％酵母粉、2％蛋白胨、0.3％干酪素、5mM EDTA、0.1M精氨酸及0.1％吐溫20，溫

4、度控制在25℃，pH6.8，此后每隔24h添加一次0.3％干酪素和0.1％吐溫20，誘導(dǎo)48小時(shí)后溫度降為22℃。總誘導(dǎo)時(shí)間約70h。放罐時(shí)發(fā)酵總體積約90L，發(fā)酵上清約60L，蛋白表達(dá)總量在1.2g/L以上。該工藝共分三個(gè)階段，約95h，整個(gè)過(guò)程pH用濃氨水控制，溶氧用空氣和氧氣混合控制。
　　3.通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳法對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了定性分析，結(jié)果表明表達(dá)產(chǎn)物與rhIL-11標(biāo)準(zhǔn)品具有相同的相對(duì)分子量。通過(guò)以上多方面的