重組人肝再生增強(qiáng)因子的克隆和在畢赤酵母中初步表達(dá).pdf

1、肝再生增強(qiáng)因子(augmenter of liver regeneration，ALR)有促進(jìn)肝細(xì)胞再生、抗肝纖維化等作用，對(duì)各種原因的肝衰竭、重型肝炎等情況下的肝細(xì)胞再生有重要作用。本研究已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了人肝再生增強(qiáng)因子(human augmenter of liver regeneration，h—ALR)在大腸桿菌中的表達(dá)，但表達(dá)產(chǎn)物是以無(wú)活性的單體形式(15KD)存在。由于真核表達(dá)系統(tǒng)—畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)對(duì)所表達(dá)蛋白有磷酸化、糖基化、二

2、硫鍵形成等蛋白加工功能，且迄今已有多種蛋白實(shí)現(xiàn)了在畢赤酵母中的活性表達(dá)。所以我們擬實(shí)現(xiàn)人肝再生增強(qiáng)因子在畢赤酵母中的表達(dá)，以期得到有活性的蛋白。 本研究分兩部分進(jìn)行研究。 第一部分，在大腸桿菌DH5α中實(shí)現(xiàn)人肝再生增強(qiáng)因子重組克隆的構(gòu)建。以本實(shí)驗(yàn)室保存菌株為模板，利用PCR擴(kuò)增方法，克隆得到預(yù)期大小基因，約為424bp。之后通過(guò)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切作用，將同樣經(jīng)過(guò)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切作用的載體pPIC3.

3、5K連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，抽提陽(yáng)性大腸桿菌DH5α的質(zhì)粒行BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切和PCR初步鑒定后，將陽(yáng)性重組載體送檢測(cè)序，最后成功構(gòu)建重組載體pPIC3.5K—ALR。 第二部分，將重組表達(dá)載體pPIC3.5K—ALR用SalⅠ酶切使其線性化后，電轉(zhuǎn)化感受態(tài)宿主菌GS115，通過(guò)MM和MD平板篩選得到Mut+轉(zhuǎn)化子，并通過(guò)PCR檢測(cè)篩選得到陽(yáng)性重組畢赤酵母菌株。轉(zhuǎn)化后陽(yáng)性菌株經(jīng)BMMY誘導(dǎo)后，分別在誘