人HSPC117基因?qū)?xì)胞遷移行為影響及基因表觀調(diào)控的初步研究.pdf

1、人造血干細(xì)胞117蛋白(Hematopoietic stem/proenitor cells117，HSPC117)是最近新發(fā)現(xiàn)的一種與細(xì)胞粘附運(yùn)動(dòng)相關(guān)的蛋白，它存在于大多數(shù)的蛋白質(zhì)復(fù)合物之中，在哺乳動(dòng)物與嚙齒動(dòng)物體內(nèi)廣泛表達(dá)。HSPC117能夠抑制細(xì)胞的粘附、鋪展，參與調(diào)控某些組織器官的發(fā)育以及親、子代間表型的差異變化，更與克隆胚胎的正常發(fā)生、發(fā)育密切相關(guān)，因此對(duì)HSPC117基因進(jìn)行相關(guān)研究不僅為掌握該基因的更多功能提供必要信息，更

2、為與其相關(guān)的科研領(lǐng)域奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 本實(shí)驗(yàn)以人HSPC117基因?yàn)檠芯繉?duì)象，采用克隆測(cè)序、基因重組等方法構(gòu)建了人pEGFP-C1-HSPC117真核表達(dá)載體，采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法將EGFP與HSPC117形成的融合蛋白瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入人絨毛膜癌細(xì)胞株JEG-3，通過對(duì)綠色熒光的觀察對(duì)HSPC117基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位;采用Real-time PCR方法檢測(cè)HSPC117基因過表達(dá)對(duì)細(xì)胞粘附相關(guān)基因MMP-2、MMP-14和TI

3、MP-2基因表達(dá)的影響，利用細(xì)胞劃痕方法構(gòu)建培養(yǎng)細(xì)胞傷口模型，以細(xì)胞相對(duì)遷移速率評(píng)估HSPC117基因過表達(dá)對(duì)細(xì)胞遷移行為的影響。利用組蛋白去乙?；种苿┣乓志谹(TSA)和DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷（5-aza-CdR）以不同方式處理JEG-3細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞中HSPC117基因表達(dá)量變化情況。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果如下:
　　 (1)成功克隆了人HSPC117基因完整編碼區(qū)序列，大小為1518bp，編碼505

4、個(gè)氨基酸。
　　 (2)成功構(gòu)建了pEGFP-C1-HSPC117真核表達(dá)載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染JEG-3細(xì)胞，熒光倒置顯微鏡觀察到HSPC117蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，無(wú)明顯的膜定位現(xiàn)象。
　　 (3)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-HSPC117重組質(zhì)粒48h后，Real-time PCR檢測(cè)JEG-3細(xì)胞中MMP-2基因、MMP-14基因和TIMP-2基因相對(duì)表達(dá)量變化情況。結(jié)果顯示，伴隨著HSPC117基因的過表達(dá)，MMP-2

5、基因、MMP-14基因的相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P＜0.05)，TIMP-2基因相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P＜0.05)。
　　 (4)將瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-HSPC117質(zhì)粒、pEGFP-C1質(zhì)粒和未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的JEG-3細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞劃痕試驗(yàn)，分別在劃痕后0h、24h、48h和72h測(cè)量、計(jì)算各組細(xì)胞的相對(duì)遷移速率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)HSPC117基因的JEG-3細(xì)胞細(xì)胞相對(duì)遷移速率與對(duì)照組相比受到抑制，且在劃痕后24h抑制作

6、用最明顯(P＜0.05)。
　　 (5)利用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測(cè)不同濃度TSA和5-aza-CdR對(duì)JEG-3細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種藥物均可對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)起到抑制作用，且抑制作用具有濃度依賴性，75nmol/L的TSA和50nmol/L的5-aza-CdR分別是抑制JEG-3細(xì)胞生長(zhǎng)的最強(qiáng)藥物濃度。
　　 (6)采用75nmol/L的TSA與50nmol/L的5-aza-CdR分別及聯(lián)合處理JEG-3細(xì)