人HSPC117基因?qū)毎w移行為影響及基因表觀調(diào)控的初步研究.pdf

1、人造血干細胞117蛋白(Hematopoietic stem/proenitor cells117，HSPC117)是最近新發(fā)現(xiàn)的一種與細胞粘附運動相關的蛋白，它存在于大多數(shù)的蛋白質(zhì)復合物之中，在哺乳動物與嚙齒動物體內(nèi)廣泛表達。HSPC117能夠抑制細胞的粘附、鋪展，參與調(diào)控某些組織器官的發(fā)育以及親、子代間表型的差異變化，更與克隆胚胎的正常發(fā)生、發(fā)育密切相關，因此對HSPC117基因進行相關研究不僅為掌握該基因的更多功能提供必要信息，更

2、為與其相關的科研領域奠定實驗基礎。
　　 本實驗以人HSPC117基因為研究對象，采用克隆測序、基因重組等方法構(gòu)建了人pEGFP-C1-HSPC117真核表達載體，采用脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)染方法將EGFP與HSPC117形成的融合蛋白瞬時轉(zhuǎn)染入人絨毛膜癌細胞株JEG-3，通過對綠色熒光的觀察對HSPC117基因進行亞細胞定位;采用Real-time PCR方法檢測HSPC117基因過表達對細胞粘附相關基因MMP-2、MMP-14和TI

3、MP-2基因表達的影響，利用細胞劃痕方法構(gòu)建培養(yǎng)細胞傷口模型，以細胞相對遷移速率評估HSPC117基因過表達對細胞遷移行為的影響。利用組蛋白去乙酰化抑制劑曲古抑菌素A(TSA)和DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷（5-aza-CdR）以不同方式處理JEG-3細胞，檢測細胞中HSPC117基因表達量變化情況。本實驗研究結(jié)果如下:
　　 (1)成功克隆了人HSPC117基因完整編碼區(qū)序列，大小為1518bp，編碼505

4、個氨基酸。
　　 (2)成功構(gòu)建了pEGFP-C1-HSPC117真核表達載體，瞬時轉(zhuǎn)染JEG-3細胞，熒光倒置顯微鏡觀察到HSPC117蛋白主要表達于細胞質(zhì)中，無明顯的膜定位現(xiàn)象。
　　 (3)瞬時轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-HSPC117重組質(zhì)粒48h后，Real-time PCR檢測JEG-3細胞中MMP-2基因、MMP-14基因和TIMP-2基因相對表達量變化情況。結(jié)果顯示，伴隨著HSPC117基因的過表達，MMP-2

5、基因、MMP-14基因的相對表達量顯著降低(P＜0.05)，TIMP-2基因相對表達量顯著升高(P＜0.05)。
　　 (4)將瞬時轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-HSPC117質(zhì)粒、pEGFP-C1質(zhì)粒和未進行轉(zhuǎn)染的JEG-3細胞同時進行細胞劃痕試驗，分別在劃痕后0h、24h、48h和72h測量、計算各組細胞的相對遷移速率，實驗結(jié)果顯示，過表達HSPC117基因的JEG-3細胞細胞相對遷移速率與對照組相比受到抑制，且在劃痕后24h抑制作

6、用最明顯(P＜0.05)。
　　 (5)利用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測不同濃度TSA和5-aza-CdR對JEG-3細胞生長的影響，實驗結(jié)果顯示，兩種藥物均可對細胞生長起到抑制作用，且抑制作用具有濃度依賴性，75nmol/L的TSA和50nmol/L的5-aza-CdR分別是抑制JEG-3細胞生長的最強藥物濃度。
　　 (6)采用75nmol/L的TSA與50nmol/L的5-aza-CdR分別及聯(lián)合處理JEG-3細