嗜酸乳桿菌胞壁肽聚糖的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)與機(jī)理研究.pdf

1、乳酸菌作為一類(lèi)重要的腸道定植型益生菌，被廣泛的應(yīng)用于發(fā)酵食品中，尤其是酸乳，干酪，泡菜等。同時(shí)，關(guān)于腸內(nèi)乳酸菌與宿主健康的密切關(guān)系，也越來(lái)越多的被國(guó)內(nèi)外微生物學(xué)家闡述。
　　肽聚糖(peptidoglycan，PGN)作為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，其基本結(jié)構(gòu)是由N-乙酰葡糖胺與N-乙酰胞壁酸通過(guò)β-1，4糖苷鍵連接，并在重復(fù)的單元之間通過(guò)四肽或者五肽的橋連結(jié)構(gòu)構(gòu)成的多聚網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。其中，PGN的重復(fù)二糖結(jié)構(gòu)N-乙酰葡聚糖和胞壁

2、酸δ-內(nèi)酰胺殘基大約占據(jù)了PGN成分的50％。PGN作為一種免疫增強(qiáng)劑，對(duì)其在誘導(dǎo)有關(guān)免疫調(diào)控因子的釋放來(lái)刺激免疫系統(tǒng)發(fā)揮其抗感染、抗腫瘤等生物效應(yīng)方面的研究已初見(jiàn)端倪，但其激活巨噬細(xì)胞的具體信號(hào)通路仍不清晰，它在免疫系統(tǒng)中的作用機(jī)理也有待進(jìn)一步探索。對(duì)PGN的高效分離利用，將對(duì)生物病害防治提供更多更可靠的天然生物免疫強(qiáng)化劑。
　　腸道益生菌細(xì)胞壁PGN的免疫學(xué)研究，目前主要集中在雙歧桿菌PGN方面。嬰兒型雙歧桿菌的PGN能促使小

3、鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌多量的IL-1β、IL-6和TNF-α;同時(shí)部分研究發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌的完整PGN可以對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生不同程度的免疫調(diào)節(jié)作用，激活巨噬細(xì)胞從而抑制多種腫瘤的發(fā)生。嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus，L.acidophilus)作為一種重要的腸道益生菌，通過(guò)調(diào)節(jié)腸道免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫功能，對(duì)機(jī)體健康具有重要作用。本實(shí)驗(yàn)室已從海洋魚(yú)類(lèi)腸道分離出一種抗氧化型嗜酸乳桿菌，并對(duì)其進(jìn)行了相關(guān)前期

4、研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)其有較高的DPPH清除能力(24.42％)，且對(duì)新霉素、菌必治、丁胺卡那霉素、慶大霉素等常見(jiàn)藥物有一定耐性。
　　本課題利用分離出的L.acidophilus作為研究對(duì)象，通過(guò)微生物發(fā)酵技術(shù)，分離純化得到L.acidophilus的PGN成分。但由于PGN過(guò)高的聚合度，限制了其溶解度，從而對(duì)其發(fā)揮免疫活性產(chǎn)生了重要的障礙。我們采取了部分水解的方法，提高了PGN的溶解度，在一定程度上增強(qiáng)其在免疫活性方面的活性。在分離純

5、化L.acidophilus細(xì)胞壁PGN的研究中，利用HPLC，NMR, FT-RI，MALDI-TOF/TOF及氨基酸成分分析，確定L.acidophilus菌株的細(xì)胞壁PGN結(jié)構(gòu)單體為NAG-(β-1,4)-NAM-L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala。
　　通過(guò)在LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7炎癥模型中，采用蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)PGN聚合物，PGN水解產(chǎn)物以及PGN單體成

6、分對(duì)LPS引起的炎癥反應(yīng)具有較好的抑炎調(diào)節(jié)功能。而且抑炎活性以N-乙酰胞壁酸(NAM)的作用最為顯著。在對(duì)核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)通路及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑的深入研究中，發(fā)現(xiàn)NAM的抑制作用是通過(guò)TLR4與NF-κb信號(hào)途徑的相互交互，通過(guò)p38-MAPK激酶通路，抑制NF-kB的核轉(zhuǎn)錄，限制炎癥因子的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。在進(jìn)一步的研究中，我們利用系統(tǒng)蛋白組學(xué)的研究方法，同位素相對(duì)標(biāo)記與絕對(duì)定量(iTRAQ)技術(shù)發(fā)現(xiàn)了鈣信號(hào)途徑

7、與p38-MAPK途徑的相互關(guān)系。NAM處理組中，NAM通過(guò)上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶(SERCA)在的表達(dá)，調(diào)節(jié)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上SERCA依賴(lài)的鈣離子流動(dòng)方向，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)NAM介導(dǎo)的抑炎活性發(fā)揮作用。體內(nèi)小鼠試驗(yàn)，我們采用致病性大腸桿菌灌注作為小鼠炎癥模型，來(lái)觀(guān)察PGN，PGN水解物以及NAM的抑炎效果。小鼠腸道免疫切片及腸道炎癥因子的觀(guān)察結(jié)果證明嗜酸乳桿菌PGN及其單體成分NAM確實(shí)可以對(duì)小鼠腸道起到很好的抑炎作用。
　　本研究為嗜