高產(chǎn)胞外多糖嗜酸乳桿菌篩選、發(fā)酵條件優(yōu)化及多糖結(jié)構(gòu)分析.pdf

1、多糖(polysaccharide)是由多個(gè)單糖分子縮合、失水而成，符合高分子化合物概念的碳水化合物及其衍生物。細(xì)菌多糖主要以三種形式存在：胞內(nèi)多糖、胞壁多糖和胞外多糖。胞內(nèi)多糖主要是以糖原形式存在，起到儲(chǔ)存能量的作用。胞壁多糖是維持細(xì)胞形態(tài)的結(jié)構(gòu)性多糖，其主要成分是多糖類物質(zhì)和蛋白質(zhì)與脂類相結(jié)合形成的，如肽聚糖、脂多糖和磷壁酸等。廣義上的胞外多糖指的是糖被(glycocalyx)，其主要作用是起到保護(hù)細(xì)菌免受缺水、宿主細(xì)胞的吞噬、儲(chǔ)藏

2、養(yǎng)料、堆積某些代謝產(chǎn)物和表面吸附的作用。包括微莢膜、莢膜、黏液層和菌膠團(tuán)。狹義上的胞外多糖指的是黏液層，即是一種擴(kuò)散到培養(yǎng)基中的多糖物質(zhì)，也是人們通常所說的胞外多糖。 乳酸菌是人體腸道內(nèi)定植的一類固有益生菌，是一類能發(fā)酵利用碳水化合物并產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌。美國FDA已經(jīng)確認(rèn)其為對(duì)人體安全的發(fā)酵菌種。其中嗜酸乳桿菌是人體腸道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌群之一。嗜酸乳桿菌是歷史悠久的工業(yè)發(fā)酵菌種，其在應(yīng)用上已具有比較明顯的優(yōu)勢(shì)。嗜酸乳桿菌胞外多糖不僅

3、對(duì)乳制品的質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味具有重要影響，而且有可能成為食品級(jí)多糖的一個(gè)極好的來源而廣泛應(yīng)用于各種食品的增稠、穩(wěn)定、乳化、膠凝及保濕。 目前國內(nèi)外對(duì)于細(xì)菌多糖的研究比較深入，但是乳酸菌胞外多糖的研究才剛剛起步，一些乳酸菌多糖的結(jié)構(gòu)和生物活性功能還沒有得到確定和證實(shí)。乳酸菌的發(fā)酵條件和產(chǎn)多糖的環(huán)境因素影響還有待探討。本文以嗜酸乳桿菌為研究對(duì)象，對(duì)其產(chǎn)多糖的條件和影響因素進(jìn)行了初步探討；研究了在特定的環(huán)境下，嗜酸乳桿菌產(chǎn)的胞外多糖提取工藝、

4、分離純化以及結(jié)構(gòu)鑒定；通過生物學(xué)的方法進(jìn)行誘變育種以篩選高產(chǎn)胞外多糖的菌株；通過發(fā)酵條件的優(yōu)化得到理想產(chǎn)量的嗜酸乳桿菌胞外多糖，為達(dá)到能夠?qū)崿F(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的目的提供理論基礎(chǔ)。 采用鏡檢觀察所選菌株的形態(tài)特征的方法從市售酸奶中分離出疑似菌株，通過明膠液化、接觸酶反應(yīng)、硝酸鹽還原、吲哚以及硫化氫反應(yīng)確定乳桿菌屬。最后通過糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)和16sDNA鑒定確定嗜酸乳桿菌并通過化學(xué)誘變的方法篩選得到高產(chǎn)胞外多糖的嗜酸乳桿菌菌株，最高產(chǎn)量達(dá)到6.

5、46g/L。 采用不同的發(fā)酵條件進(jìn)行發(fā)酵，檢測(cè)其胞外多糖的產(chǎn)量。利用Placket-Burman(非對(duì)稱二元設(shè)計(jì))對(duì)影響產(chǎn)量的16個(gè)因素進(jìn)行分析得出對(duì)其發(fā)酵影響最大的3個(gè)因素；然后通過快速響應(yīng)曲面的方法對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，使得胞外多糖產(chǎn)量達(dá)到3.85g/L 發(fā)酵液經(jīng)酒精沉淀4℃浸提過夜。以酒精濃度、料液比、浸提時(shí)間分別為影響因子進(jìn)行三元二次旋轉(zhuǎn)正交實(shí)驗(yàn)得出嗜酸乳桿菌胞外多糖的最佳提取工藝是：80％酒精濃度下，以1:1.

6、8的料液比抽提12h，胞外多糖產(chǎn)量達(dá)到1.91g/L。 將上述各優(yōu)化條件結(jié)合起來進(jìn)行多糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)分別得到產(chǎn)量為8.5g/L、8.7g/L和8.1g/L，比原來產(chǎn)量提高462％。遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于國內(nèi)報(bào)道產(chǎn)量，接近國際報(bào)道產(chǎn)量。 將得到的沉淀物用蒸餾水復(fù)溶透析48h之后冷凍干燥。然后分別用DEAE-Cellulose52和SephMexG-200進(jìn)行純化得到帶電荷的最大分子量級(jí)份以備結(jié)構(gòu)分析。利用傅立葉紅外和氣相分析儀測(cè)定了嗜酸乳桿