家蠶BmDichaete基因的克隆及功能初探.pdf

1、Sox基因家族是一類重要的轉錄因子家族。自從1990年Sinclair等在人類和小鼠中克隆了哺乳動物性別決定基因——睪丸決定因子SRY/Sry(sex-determiningregionofY)基因后,一系列與之同源、編碼轉錄因子的基因相繼被發(fā)現(xiàn),統(tǒng)稱為Sox基因家族。Sox基因家族是存在于動物個體中的與動物性別決定因子SRY具有高度序列相似性的一類轉錄因子家族,其特征是含有一個高度保守的與DNA結合相關的高遷移率盒(highmobil

2、itybox,HMG-box)結構域。Sox基因家族廣泛參與了生物多種發(fā)育過程,在動物性別決定與分化、生殖腺發(fā)育、早期胚胎發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、軟骨發(fā)生及血管發(fā)生等多種組織器官的形成過程中發(fā)揮著重要的生物學作用。
　　 家蠶是鱗翅目昆蟲的典型代表,是一類重要的經(jīng)濟昆蟲,也是良好的模式生物,但家蠶Sox基因的研究還處于起步階段。Dichaete基因屬于Sox基因家族B亞族基因,首先在黑腹果蠅中被發(fā)現(xiàn),與哺乳動物中的Sox2同源性最高

3、,自發(fā)現(xiàn)以來即受到廣泛的關注。該基因也是作為一種轉錄因子參與個體發(fā)育特別是個體神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的調控,它還參與了個體后腸發(fā)育、卵母細胞形成等多種發(fā)育過程。
　　 本文基于其他模式生物的先進研究成果及家蠶基因組信息,分析并克隆了果蠅Dichaete基因的家蠶同源基因BmDichaete基因,并對其表達及功能進行了研究,得到了如下研究結果。
　　 1,家蠶BmDichaete基因的克隆及序列分析
　　 利用家蠶EST數(shù)據(jù)

4、電子克隆了果蠅DmDichaete基因在家蠶中的同源體,定位于第四號染色體nscarf2589上,命名為BmDichaete。通過Race技術成功克隆了家蠶BmDichaete基因完整的cDNA序列,全長為1541bp,其ORF長741bp(ORF:112-852),編碼246個氨基酸,預測蛋白的分子量大小為27.3kDa,等電點為9.89。通過結構域預測,編碼蛋白的第39個氨基酸到第107個氨基酸之間,有一個Sox基因家族的保守結構域

5、HMG-box?；蚪M序列分析結果顯示BmDichaete基因完整的ORF即為一個外顯子,不含有內含子結構,這也同Sox基因家族B亞族基因的特點相吻合。同源性分析結果表明,BmDichaete基因在進化上高度保守,與其脊椎動物及非脊椎動物中的同源基因在HMG-box結構域內高度保守(≥90%),在HMG-box區(qū)外也有一定的序列相似性;家蠶中Sox基因成員之間在HMG-box區(qū)保守性約為50%,HMG-box區(qū)外基本無序列相似性。

6、>　　 2,家蠶BmDichaete基因的原核表達
　　 由于BmDichaete基因與亞族內的其它基因相比,它們在HMG-box區(qū)的序列相似性達到了90%以上,為了研究方便,實驗中我們表達了兩段BmDichaete基因的片段。根據(jù)BmDichaete基因的完整cDNA序列設計引物,體外克隆BmDichaete基因的ORF及不含有保守結構域HMG-box的特異序列。將目的片段序列亞克隆到pET-28a-c(+)表達載體,構建重

7、組表達質粒,將該重組質粒轉化到BL21表達宿主菌中,用IPTG誘導BmDichaete-pET-28a-c(+)/BL21表達目的蛋白。由于加了組氨酸標簽,目的蛋白大小分別為32.3kD租17kD,與預測結果一致。該蛋白以包涵體的形式存在。IPTG濃度和誘導時間對BmDichaete蛋白的表達影響不大,但誘導溫度會顯著影響目的蛋白的表達量。本實驗最終采用0.4mMIPTG、37℃誘導5h來誘導目的蛋白的表達。
　　 3,家蠶Bm

8、Dichacte蛋白抗體的制備
　　 以純化的BmDichaetc特異片段蛋白為抗原制備了抗體,并用飽和硫酸銨鹽析法純化,通過間接ELISA法檢測抗體效價為1:100000。
　　 4,家蠶BmDichaete基因的表達模式分析
　　 提取家蠶發(fā)育各時期和幼蟲5齡3天各組織總RNA,利用RT-PCR技術分析BmDichaete基因在家蠶發(fā)育過程中的表達模式。研究發(fā)現(xiàn)BmDichaete在家蠶整個發(fā)育過程中都有表達

9、,蛹后期表達量降低,化蛾時基本不表達:BmDichaete基因在家蠶幼蟲期的表達還具有組織特異性,主要在神經(jīng)、頭部、卵巢、后腸及絲腺中表達。
　　 提取家蠶胚胎發(fā)育各天的蛋白進行westernblotting分析,發(fā)現(xiàn)BmDichaete基因在家蠶胚胎發(fā)育時期持續(xù)的表達。
　　 5,家蠶胚胎發(fā)育時期的RNAi
　　 通過dsRNA介導的RNAi技術,對家蠶大造品種的胚胎進行BmDichaete基因沉默。通過統(tǒng)計顯