生物降解聚乳酸-乙醇酸-己內(nèi)酯載環(huán)丙沙星的合成，表征及體外、體內(nèi)抗菌活性的研究.pdf

1、前言:
　　骨髓炎是感染性微生物引起的骨的炎癥，是由于微生物感染并導(dǎo)致骨骼破壞的炎癥反應(yīng)過程。慢性骨髓炎的治療包括手術(shù)清除失活，感染組織，骨穩(wěn)定性重建，消滅死腔，良好的軟組織覆蓋，骨重建，并聯(lián)合應(yīng)用抗生素。長(zhǎng)期全身應(yīng)用抗生素副作用大，難以在病灶局部形成高的抗生素濃度。而局部應(yīng)用藥物可以彌補(bǔ)以上缺點(diǎn)。
　　目前臨床批準(zhǔn)的聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥鏈珠載藥局部應(yīng)用治療骨髓炎雖取得一定的成功，但其仍存在藥物釋放不完全，易致細(xì)菌耐藥，需

2、二次取出等缺點(diǎn)。作為改進(jìn)，人們?cè)诳蒲兄袘?yīng)用可吸收生物材料替代骨水泥鏈珠治療動(dòng)物慢性骨髓炎取得了良好的效果。
　　聚乳酸乙醇酸酯是最為常用的聚酯類生物可吸收材料，是良好的局部抗生素載體。但其質(zhì)硬，可產(chǎn)生大量酸性降解產(chǎn)物。本研究試圖在聚乳酸乙醇酸酯中引入丙交酯單體，合成一種酸性降解產(chǎn)物更少，具有彈性的新的三元共聚物，并對(duì)其理化性質(zhì)，載藥后體內(nèi)體外抗菌效果做進(jìn)一步評(píng)價(jià)。
　　目的:
　　1.合成PLGC(PLA-GA-CL)

3、三元共聚物，并對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行表征。
　　2.以PLGC載環(huán)丙沙星形成復(fù)合物，進(jìn)行體外藥物釋放研究，抗菌效果研究。
　　3.構(gòu)建大鼠慢性骨髓炎模型，進(jìn)行PLGC復(fù)合物的體內(nèi)抗菌實(shí)驗(yàn)研究。
　　研究方法:
　　1.三元共聚物PLGC的合成:PLGC通過DLLA、GA與CL的的本體開環(huán)聚合反應(yīng)制備而得。所有共聚反應(yīng)均在130±2℃下進(jìn)行24h，制成棒狀以進(jìn)行力學(xué)實(shí)驗(yàn)。
　　2.三元共聚物的體外水解及酶解:將PL

4、GC裁成長(zhǎng)為40mm的植入劑，精密稱重后將植入劑置于20 mL pH=7.4的PBS溶液中，并置于37℃空氣浴中，每天振蕩8h，振幅為65次/分，PBS溶液每周更換一次。分別在第1、2、3、4、5、6、7周取出樣品，干燥，稱重。聚合物降解前后介質(zhì)的pH通過配備三合一微量電極的pH計(jì)進(jìn)行測(cè)試。
　　3.力學(xué)性能分析:采用拉力實(shí)驗(yàn)機(jī)對(duì)聚合物的力學(xué)性能進(jìn)行測(cè)試，測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)參照國(guó)標(biāo)GB/T1040.1-2006，夾頭速度50mm/min。每

5、種樣品平行操作5個(gè)樣品，結(jié)果為平均值。
　　4.PLGC復(fù)合物的制作:精確稱量5g PLGC三元共聚物，并將其溶解在氯仿中，然后按照藥物與載體材料的重量比為1∶10加入環(huán)丙沙星藥物0.5g，攪拌均勻后，澆鑄在培養(yǎng)皿中，待氯仿完全揮發(fā)后揭下藥膜，干燥至恒重。
　　5.PLGC復(fù)合物的體外釋放藥物檢測(cè):取載藥顆粒100mg為一組，共3組作為3個(gè)平行樣品，以空白載體材料PLGC作為空白對(duì)照，分別用10mL蒸餾水浸泡，置于（37±1

6、）℃恒溫空氣浴中振搖，每24h更換一次蒸餾水，在波長(zhǎng)271nm處測(cè)定釋放液的吸收度A，由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算藥物濃度按回歸方程計(jì)算釋藥量。
　　6.PLGC復(fù)合物釋放藥物后電鏡檢測(cè):復(fù)合物在未置入生理鹽水前，與置入生理鹽水30日時(shí)的樣品干燥后進(jìn)行電鏡掃描觀察形態(tài)。
　　7.PLGC復(fù)合物的細(xì)胞毒性檢測(cè):大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞購(gòu)買自廣州賽業(yè)公司，MTT方法檢測(cè)BMSCs對(duì)PLGC復(fù)合物材料浸提液的濃度梯度依賴性。利用不同濃度的浸提液

7、處理細(xì)胞，檢測(cè)MTT的OD值，反映細(xì)胞活性。
　　8.PLGC復(fù)合物體外釋放藥物的抗菌活性測(cè)定:金黃色葡萄球菌ATCC25923購(gòu)自上海北諾生物科技有限公司，活化后的金黃色葡萄球菌轉(zhuǎn)接到營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37℃培養(yǎng)24h后，獲得108CFU/ml的菌液，用無菌棉拭子蘸取已制備好的金黃色葡萄球菌菌液，均勻涂抹于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基上。在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上無菌打孔，加入2小時(shí)，15日，30日緩沖液100μl進(jìn)行抑菌環(huán)檢測(cè)。恒溫培養(yǎng)24h。讀取抑菌

8、環(huán)大小。
　　9.Wistar大鼠脛骨慢性骨髓炎模型的建立與處理:實(shí)驗(yàn)中所有的手術(shù)步驟都經(jīng)中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，嚴(yán)格按步驟執(zhí)行。10％水合氯醛麻醉后，無菌條件下，顯露脛骨近端1/3，以1.0mm直徑的電鉆鉆入脛骨骨髓腔，生理鹽水沖洗后以50μl的魚肝油酸鈉注射液注射進(jìn)入髓腔內(nèi)，隨后以無菌生理鹽水配置的金黃色葡萄球菌菌液50μl注射進(jìn)入髓腔內(nèi)，再以骨蠟封閉骨髓腔入口。術(shù)后4周，3只大鼠處死后行x-ray檢查，3只大鼠處死后

9、行HE染色檢查。余18只大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組，空白組，行二次手術(shù)清創(chuàng)，實(shí)驗(yàn)組骨髓腔內(nèi)植入PLGC復(fù)合物，對(duì)照組脛骨骨髓腔內(nèi)植入PLGC，空白組無植入物。每周測(cè)量大鼠體重，WBC計(jì)數(shù)變化至4周，4周時(shí)處死大鼠，行病灶處微生物學(xué)檢查，測(cè)量其內(nèi)細(xì)菌含量。
　　10.采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以(x)±S表示，實(shí)驗(yàn)組間的對(duì)比分析采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:

10、r>　　1.在所述聚合條件下，所得共聚物具有較高的產(chǎn)率(＞90％)。
　　2.當(dāng)CL含量為的20mol％和40mol％時(shí)，PLGC三元共聚物降解7周后的失重率分別為89.08％和76.74％，而PLGA幾乎降解完全。當(dāng)CL含量為的20mol％和40mol％時(shí)，PLGC三元共聚物降解3周后PH值由7.4下降至分別為6.92，7.11，而PLGA值下降至6.46。
　　3.當(dāng)CL含量由0 mol％增加至40mol％時(shí)，PLGC三

11、元共聚物的彈性模量及拉伸強(qiáng)度分別由3136 MPa，51.63 MPa降低至3.7 MPa，1.38 MPa。同時(shí)，共聚物由堅(jiān)硬材料轉(zhuǎn)變?yōu)橄鹉z態(tài)材料。
　　4.載藥過程屬于物理混合過程，對(duì)PLGC三元共聚物的性能無影響。
　　5.PLGC復(fù)合物可持續(xù)，足量釋放藥物至少33天。
　　6.初始樣品表面平整且分散藥物顆粒，30天后，釋藥后的載藥復(fù)樣品較容易脆裂，載藥樣品表面及內(nèi)部出現(xiàn)了大小不一的凹坑和孔洞。
　　7.各

12、個(gè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間結(jié)果SPSS統(tǒng)計(jì)之后無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。證明PLGC復(fù)合物沒有細(xì)胞毒性，具有良好的生物相容性。
　　8.PLGC復(fù)合物在2小時(shí)時(shí)釋放的環(huán)丙沙星溶液抗金黃色葡萄球菌的抑菌環(huán)大小為34.0±0mm，4小時(shí)，15天，30天時(shí)釋放的環(huán)丙沙星溶液產(chǎn)生的抑菌環(huán)大小分別為18.33±1.25mm,13.33±2.33mm，26.0±0mm，所釋放的藥物在檢驗(yàn)的時(shí)間點(diǎn)均具有抗菌活性。
　　9.x-ray及HE染色結(jié)果均證實(shí)，在

13、骨髓炎模型建造4周后大鼠脛骨內(nèi)形成了明確的慢性骨髓炎，二次行清創(chuàng)術(shù)后，將PLGC復(fù)合物植入實(shí)驗(yàn)組大鼠體內(nèi)，治療4周后實(shí)驗(yàn)組大鼠體重回升，WBC明顯降，與對(duì)照組及空白組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。微生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組大鼠病灶內(nèi)細(xì)菌含量明顯減低，與對(duì)照組及空白組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　PLGC聚合物有著與PLGA相似的特征，可以替代PLGA作為藥物載體。但其有低酸性的特點(diǎn)，可降低病灶局部的炎性反應(yīng)，也是對(duì)PH值敏感