蠟梅胰蛋白酶抑制劑基因CpKTI的克隆及功能初步分析.pdf

1、胰蛋白酶抑制劑(TI，Trypsin Inhibitor)是廣泛存在于動植物、微生物和病毒中的一類防御蛋白。近年來，TI已經(jīng)成為抗蟲基因資源的一大種類。按照氨基酸序列同源性，胰蛋白酶抑制劑可以分為Bowman-Birk型(Bowman-Birk inhibitor，BBI)和Kunitz型(Kunitz trypsin in hibitor，KTI)兩類。其中KTI是一類分子量為20～25kD的蛋白，其分子組成特點(diǎn)是N端有一個由20aa

2、組成的信號肽，均存在一個比較典型的kunitz結(jié)構(gòu)域。其空間結(jié)構(gòu)只有一個活性中心，特異地與胰蛋白酶作用。KTI可以抵御害蟲對植物的侵害。當(dāng)昆蟲取食時，KTI可與昆蟲中腸消化道中的消化酶結(jié)合形成酶抑制劑復(fù)合物，導(dǎo)致昆蟲異常消化和影響對必須氨基酸的吸收，從而使生長發(fā)育受阻，導(dǎo)致饑餓而死。
　　 本論文在實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建好的蠟梅花cDNA文庫并進(jìn)行EST分析的基礎(chǔ)上，通過隨機(jī)克隆測序，得到了1個胰蛋白酶抑制劑基因cDNA序列，將其命名為

3、CpKTI(GenBank登錄號:DW223520)。在借助生物信息學(xué)對該基因進(jìn)行序列特征和進(jìn)化分析的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了植物表達(dá)載體使其在煙草中表達(dá)，并探討了轉(zhuǎn)基因煙草的抗蟲性;通過轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)分析，研究了該基因的組織表達(dá)情況;同時構(gòu)建了原核表達(dá)載體，并誘導(dǎo)了蛋白表達(dá)。結(jié)果如下:
　　 1.CpKTI的分子特征
　　 CpKTIcDNA全長為845bp，其中開放閱讀框594bp，編碼197個氨基酸。序列結(jié)構(gòu)分析顯示:CpK

4、TI編碼蛋白N端有一個21aa的信號肽和一個典型的kunitz結(jié)構(gòu)域。其氨基酸序列與向日葵、煙草、擬南芥、花生、歐洲山楊的同源性較高。二級結(jié)構(gòu)由α螺旋(α-helix，8.63％)、延伸鏈(Extendedstrand，34.52％)、β轉(zhuǎn)角(Beraturn，5.08％)、隨機(jī)卷曲(Randomcoil，51.78％)組成，有6個半胱氨酸殘基，其中C61-C106形成一個二硫鍵。三級結(jié)構(gòu)呈典型的B三葉草折疊構(gòu)象。
　　 2.C

5、pKTI表達(dá)的轉(zhuǎn)錄水平變化
　　 實(shí)時熒光定量PCR分析表明:CpKTI在蠟梅不同組織中均有表達(dá)，其中在雄蕊中的表達(dá)量最高，其次是在莖中表達(dá)較高，具有較強(qiáng)的組織特異性。CpKTI在蠟梅單花開放過程中，均有不同程度的表達(dá)，尤其在落花期時表達(dá)量最高，具有較強(qiáng)的時間特異性。根據(jù)蠟梅的種實(shí)發(fā)育期，推測CpKTI基因?qū)ΨN子貯藏蛋白形成可能有重要的作用。還推測CpKTI在莖中的高表達(dá)可能有促進(jìn)花枝形成的作用。
　　 3.CpKTI的

6、真核表達(dá)
　　 成功構(gòu)建了植物表達(dá)載體CpKTI-pC2301G，并獲得轉(zhuǎn)基因煙草。采用生物脅迫進(jìn)行轉(zhuǎn)基因煙草的抗性鑒定。以斜紋夜蛾作為供試?yán)ハx，用離體葉片飼喂法和室外罩籠法測定各項(xiàng)抗性指標(biāo):昆蟲取食量、體重、蛻皮情況以及葉片受害程度等。數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明:轉(zhuǎn)CpKTI基因煙草的部分株系較野生煙草有極顯著的抗蟲特性。進(jìn)入暴食期的斜紋夜蛾幼蟲，基本轉(zhuǎn)移至對照煙草上取食，對轉(zhuǎn)基因煙草有趨避性。部分接在轉(zhuǎn)基因植株上的昆蟲在3齡期就死亡。