辣椒快速繁殖體系的建立及豇豆胰蛋白酶抑制劑基因轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、遼寧師范大學(xué)碩士學(xué)位論文辣椒快速繁殖體系的建立及豇豆胰蛋白酶抑制劑基因轉(zhuǎn)化的研究姓名：王朋申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：植物學(xué)指導(dǎo)教師：王關(guān)林20000601辣椒快速繁殖體系的建立及豇豆胰蛋白酶抑制劑基固轉(zhuǎn)化的研究1 抗蟲植物基因工程進展1 ．1 植物基因工程概述植物基因工程是近年來隨著D N A 重組技術(shù)、植物組織培養(yǎng)及遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)、外源基因表達的檢測技術(shù)的發(fā)展而迅速興起的新學(xué)科。采用工程設(shè)計的方式，通過D N A 體外重組技術(shù)將特定的外源

2、D N A 導(dǎo)入受體細胞中，由此獲得的轉(zhuǎn)化植株可表現(xiàn)出預(yù)期的遺傳特性。白七十年代末根癌農(nóng)桿菌T i 質(zhì)粒介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)建立以來，外源基因轉(zhuǎn)化技術(shù)不斷完善。目前，已有2 0 0 多種轉(zhuǎn)基因植物問世．其中包括大豆、胡蘿h 、番茄、馬鈴薯、小麥、玉米、水稻等。植物基因工程已逐漸走向應(yīng)用階段，批準進入田間實驗的轉(zhuǎn)基因植物超過5 0 0 例( 賈士榮．1 9 9 4 ) 。植物基因工程不但在植物的抗病、抗蟲、抗除草劑、抗逆境方面取得了重要進展

3、，在培育作物的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、延長果蔬貯存時間、培育雄性不育材料方面取得了重要突破。M o n s a n t o 公司轉(zhuǎn)蘇云桿菌毒蛋白( B t t o x i n )基因的棉花經(jīng)數(shù)年田間實驗，表現(xiàn)出顯著的抗棉鈴蟲和紅鈴蟲能力。植物基因工程涉及以下幾個重要的技術(shù)環(huán)節(jié)：( 1 ) 目的基因的分離鑒定和修飾；( 2 ) 植物表達載體的構(gòu)建；( 3 ) 植物受體的遺傳轉(zhuǎn)化；( 4 ) 轉(zhuǎn)化細胞和植株的篩選及鑒定，這些環(huán)節(jié)都已取得重大突破，推動了植

4、物基因工程的發(fā)展。進行植物基因工程操作，其前提是獲得目的基因。至今已分離的供植物基因工程使用的基因有幾百個，包括抗病基因、抗蟲基因、抗除草劑基因，以及提高植物體中蛋白質(zhì)含量或品質(zhì)的基因等。目的基因?qū)胫参锛毎杞柚参锉磉_載體。構(gòu)建植物表達載體就是在目的基因的5 一’端加上啟動子，在3 一’端加上終止子．以使外源基因能在植物細胞內(nèi)有效地表達。外植體經(jīng)轉(zhuǎn)化后，只有極少數(shù)細胞中導(dǎo)入了外源D N A ，因此需淘汰非轉(zhuǎn)化細胞。目前常在表達載體中

5、加入篩選標記基因( 如抗菌素抗性基因和抗除草劑基因) 以利于后期的篩選；為了快速簡易區(qū)分轉(zhuǎn)化體還常用到報告基因( R e p o r t e r g e n e ) ，其中以葡聚糖醛酸苷酶( B —G 1 U C F O r l a S e ，G U S ) 基因應(yīng)用居多。目的基因引入過程是基因工程操作的重要一環(huán)，植物的遺傳轉(zhuǎn)化是指利用生物及物理化學(xué)手段將外源基因?qū)胫参锛毎募夹g(shù)。迄今已建立1 1 種基因轉(zhuǎn)化方法，按轉(zhuǎn)化原理可分為種質(zhì)

6、轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，直接轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和載體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)( 王關(guān)林，1 9 9 8 ) 。其中農(nóng)桿菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化系統(tǒng)最為成熟，獲得成功的例子最多。轉(zhuǎn)化的外植體采用質(zhì)粒D N A 篩選標記基因編碼的抗生素或除草劑等進行篩選，淘汰掉非轉(zhuǎn)化細胞，然后利用植物細胞全能性使轉(zhuǎn)化細胞再生成完整植株。由于轉(zhuǎn)化細胞與非轉(zhuǎn)化細胞間的物質(zhì)交流會產(chǎn)生交叉保護現(xiàn)象，也有少數(shù)非轉(zhuǎn)化細胞在篩選過程中得以生長并產(chǎn)生假陽性植株，因而對經(jīng)篩選的植株仍需進一步進行分子鑒定?？捎肞 C R 和S

7、o u t h e r nb l o t 法鑒定目的基因的整合；通過N o r t h e r nb l o t 確定外源D N E 的整合與轉(zhuǎn)錄；利用w e s t e r nb l o t 和E L I S E 技術(shù)驗證外源D N A 在宿主細胞內(nèi)的翻譯表達。利用上述各種手段，植物基因工程取得了很大發(fā)展，給農(nóng)作物育種提供了一條非常有效的途徑，其中阻抗蟲植物基因工程獲得的成效晟為顯著。1 ．2 抗蟲植物基因工程農(nóng)作物蟲害給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來