Toll-like receptor2-4在冠狀動脈內皮細胞炎癥反應調控中的作用.pdf

1、研究背景
　　 目前,已經有許多研究證實血管炎癥與血管動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展密切相關,在心血管疾病病理過程中起了非常重要的作用。其中,作為血管的重要組成部分,內皮細胞在血管的免疫和炎癥反應中起著重要作用,內皮細胞內的炎癥激活是許多疾病發(fā)展的關鍵,比如其是組織缺血一再灌注損傷中單核細胞和巨噬細胞聚集和浸潤的關鍵步驟,也是動脈粥樣硬化發(fā)生的關鍵部分。
　　 Toll-like receptors(TLRs)是一種病原體功能

2、識別受體,可以識別細菌,病毒以及其它一些病原體。TLR2或者TLR4被生物配體刺激后,可以激活細胞內的傳導通路活化,誘導促炎因子的產生。因此,TLR2和TLR4在細胞內的免疫和炎癥反應中起著關鍵作用。在體內,組織缺血一再灌注損傷時可以導致許多TLR受體激活物的釋放,比如熱休克蛋白(heat shock protein,HSP)和高遷移率蛋白(high mobilit),group box1,HMGB1)。孟憲忠教授等的研究已經發(fā)現(xiàn)心肌組

3、織的TLR2/4在缺血組織中的白細胞浸潤起著非常關鍵的作用,與心肌的缺血一再灌注損傷的機制有關。目前對于TLRs在血管內皮細胞炎癥中的作用,以及內皮細胞炎癥在缺血心肌中作用尚缺乏研究。
　　 人類心血管疾病發(fā)病的性別差異已得到普遍認同。女性可以從雌激素的心血管保護作用中受益,但保護作用在婦女絕經后就終止了。這種心血管疾病的性別差異在動物中也被發(fā)現(xiàn)。幾項研究證實雌性小鼠心肌梗死后比雄性小鼠有更好的心功能,同時早期的炎癥反應減輕,纖

4、維性修復加強,左室不良重構范圍減小。而且,雌性小鼠對缺血中TNFR1通路的抵抗更強。雌激素明顯具有抗炎癥反應的作用,在雌性小鼠中具有心血管保護作用。TLR2明顯在缺血后心肌的損傷和心功能減退中起著重要作用。但是,之前這些研究都是集中在雄性小鼠的TLR2作用上面,對TLR2在雌性小鼠中的作用缺乏研究。
　　 雌激素是調節(jié)組織和細胞損傷后炎癥反應的重要因子。幾項研究提示雌激素與TLRs之間有相互作用。LPS誘導的小鼠氣道炎癥反應在雌

5、性小鼠中減輕,但在注射睪酮后增強。另外,17β-雌二醇可以通過雌激素受體,抑制TLR誘導的IL-8在囊性纖維化支氣管內上皮細胞的釋放。但是,在巨噬細胞中,去除內源性的雌激素后既可以減少促炎因子,也可以減少抗炎因子的產生,同時伴隨細胞表面TLR4表達的減少。同樣地,睪酮也可以減少巨噬細胞TLR4的表達。這些研究提示性激素可以改變TLRs的表達和TLRs介導的炎癥反應,但對于缺血后TLR2介導的炎癥反應是否有性別差異并不清楚。
　　

6、 而在1型糖尿病人群中,動脈粥樣硬化在年輕時已經發(fā)生,而且進展迅速,但是其中的機制尚不清楚。很多研究揭示TLR2和TLR4兩種受體在動脈粥樣硬化的發(fā)展機制中起著關鍵作用。另外,TLR2配體肽聚糖(peptidoglycan,PGN)和TLR4配體脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)已經被發(fā)現(xiàn)存在于血管早期粥樣硬化斑塊中。當這些細菌抗原誘導單核細胞產生大量促炎因子時,它們對冠脈內皮細胞(coronary artery e

7、ndothelial cells,CAECs)的炎癥反應的作用尚未可知。因此,對于TLR2/4刺激時1型糖尿病對CAEC炎癥反應的影響進行研究,將有助于了解這種疾病對于動脈粥樣硬化影響的機制。
　　 目前已經有研究揭示TLR2和TLR4參與了1型糖尿病的病理生理機制中。在1型糖尿病模型中,TLR2參與了胰島的自體免疫反應。在自發(fā)1型糖尿病的NOD小鼠中,骨髓來源的巨噬細胞中TLR2,以及TLR3-5的表達都升高了。胰島素也被發(fā)現(xiàn)

8、可以抑制單核細胞中TLR2轉錄水平的表達。另外,糖尿病病人中B細胞炎癥反應中TLR4的功能也發(fā)生了改變,可能是由促炎因子IL-8的升高和抗炎因子IL—10的缺乏兩種原因引起的。這些研究結果揭示了1型糖尿病中細胞TLR表達和反應發(fā)生變化與疾病有關,但是在1型糖尿病CAECs中TLR2/4的表達水平和炎癥反應的改變尚有待研究。
　　 本實驗中,我們假設TLR2和TLR4激活可以導致血管內皮細胞炎癥因子表達,TLR2受體在雌雄小鼠中的

9、作用不完全相同,1型糖尿病可以增強TLRs介導的冠狀動脈內皮細胞內的炎癥反應。我們利用TLR2受體激活劑PGN和TLR4受體激活劑LPS刺激內皮細胞內的TLRs受體,探討TLRs介導的內皮細胞炎癥反應,以及1型糖尿對其的影響和可能的機制。利用小鼠心肌梗死模型,探討TLR2在心肌梗死后的炎癥反應是否存在性別差異。
　　 第一章 TLR2和TLR4激活誘導心臟微血管內皮細胞的炎癥反應
　　 目的：
　　 研究TLR2

10、和TLR4激活誘導的心臟微血管內皮細胞內炎癥反應情況和可能的機制。
　　 方法：
　　 分離小鼠心臟微血管內皮細胞,分別予TLR2激活物PGN和TLR4激活物LPS進行干預。利用實時定量PCR方法分析ICAM-1 mRNA的表達,ELISA方法分析IL-6和IL-8的表達,免疫印跡分析ICAM-1蛋白表達和NF-κB活化的變化。
　　 結果：
　　 PGN和LPS誘導小鼠內皮細胞ICAM-1蛋白的表達在T

11、LR2敲除和TLR4突變時表達明顯減弱。TLR2和TLR4激活可以誘導微血管內皮細胞ICAM—1mRNA水平增加,ICAM—1蛋白,IL-6和IL-8表達增加,NF—κB活化增強。
　　 結論：
　　 PGN和LPS分別通過TLR2和TLR4誘導小鼠心臟微血管內皮中炎癥反應。TLR2和TLR4激活可以誘導微血管內皮細胞中的炎癥反應,其機制可能是TLR的激活增強了通路中NF-κB的活化。
　　 第二章 TLR2在心

12、肌缺血后炎癥反應和心力衰竭的作用具有性別差異
　　 目的：
　　 研究TLR2在雄性和雌性小鼠心肌梗死后的炎癥反應和左室早期不良重構中的作用。
　　 方法：
　　 在雌性和雄性野生型(Wild type,WT)和TLR2基因敲除(Knock out,KO)小鼠中結扎左前降支冠脈,制造心肌梗死模型。部分小鼠3天后處死,ELISA和免疫印跡分別分析心臟組織內MCP-1和ICAM-1表達水平,組織切片利用免疫熒

13、光方法檢測中性粒細胞的浸潤,部分小鼠7天后測量心臟功能,取心肌組織HE染色分析心肌梗死面積,免疫熒光分析單核細胞的聚集。
　　 結果：
　　 與雄性野生型小鼠相比,雄性TLR2 KO小鼠缺血心肌組織中MCP-1和ICAM-1水平降低,白細胞聚集減少,伴隨心肌梗死面積的減小和左室功能的改善。TLR2在雌性野生型小鼠心肌組織的表達沒有改變,細胞對TLR2激活物PGN的炎癥反應也相同,心肌梗死后的炎癥反應和損傷有所減輕,但TL

14、R2 KO并沒有顯示出進一步的保護作用。
　　 結論：
　　 雄性小鼠TLR2基因敲除后可以抑制缺血后心肌炎癥反應,減少心肌梗死面積和改善早期左室重構。但是,雌性小鼠并不能從TLR2基因敲除中受益。TLR2在心肌缺血后的炎癥反應和損傷中具有性別差異,提示對TLR2通路的干預作用可能只對雄性有治療意義。
　　 第三章 TLR2/4誘導人冠狀動脈內皮細胞炎癥反應的機制
　　 目的：
　　 TLR2/4

15、介導的炎癥反應在粥樣硬化中起著重要作用,探討1型糖尿病是否可以增強TLR2/4介導的冠脈內皮細胞中的炎癥反應。
　　 方法：
　　 非糖尿病和糖尿病CAECs分別予TLR2激活物PGN和TLR4激活物LPS進行干預。利用實時定量PCR方法分析ICAM-1,IL-6和IL-8mRNA的表達,免疫印跡分析ICAM-1蛋白表達,ELISA分析IL-6和IL-8小分子肽的表達,免疫印跡和免疫熒光的方法分析NF-κB的活化。另外,

16、在TLR激活之前一個小時,予糖尿病細胞胰島素處理,觀察胰島素缺乏是否為TLR2/4介導的1型糖尿病CAECs炎癥反應變化的原因。
　　 結果：
　　 TLR2和TLR4刺激可以誘導NF-κB活化,ICAM—1,IL一6和IL-8的表達。有意思的是,糖尿病細胞內炎癥產物的表達明顯增加,伴隨NF-κB活化的增強,但TLR2和TLR4蛋白水平沒有明顯改變。利用胰島素進一步的干預并沒有抑制這種增強的炎癥反應。
　　 結論

17、：
　　 糖尿病CAECs對TLR2和TLR4刺激時的炎癥反應比非糖尿病細胞增強,單獨使用胰島素并不能抑制其高炎癥反應。炎癥反應增強的機制可能與促炎因子通路的增強有關,而不在于TLR2和TLR4水平的上調。這些發(fā)現(xiàn)提示糖尿病CAECs屬于高炎癥反應細胞,這種細胞表型的改變或許是冠狀動脈粥樣硬化易患性的原因。
　　 全文小結：
　　 1.PGN和LPS是分別通過激活TLR2和TLR4受體誘導心臟微血管內皮細胞中炎癥

18、反應的發(fā)生；
　　 2.TLR2/4的激活引起了NF—κB的磷酸化,是其炎癥反應的重要調控因子；
　　 3.心肌缺血后,TLR2 KO可以抑制雄性小鼠心肌炎癥反應,減小心肌梗死面積和改善左室重構；
　　 4.雌性小鼠心肌梗死時心肌炎癥反應和心肌損傷減輕,但不能從TLR2KO中受益；
　　 5.雌性小鼠TLR2 KO作用的消失與心肌TLR2的缺失無關；
　　 6.在1型糖尿病CAECs中,TLR2和