RAS系統(tǒng)新成員在動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)疾病中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、本文分兩個(gè)論文進(jìn)行探討：
　　論文Ⅰ NKRF和C/EBP-β調(diào)控血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2表達(dá)的作用和機(jī)制研究
　　目的：
　　(1)體外實(shí)驗(yàn)中，研究ACE2啟動(dòng)子活性區(qū)域及相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子;
　　(2)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，探討轉(zhuǎn)錄因子對(duì)ACE2的調(diào)控作用及對(duì)易損斑塊的穩(wěn)定作用。
　　方法：
　　1.質(zhì)粒構(gòu)建
　　我們用pGL3-basic報(bào)告基因載體來構(gòu)建包含ACE2啟動(dòng)子片斷的質(zhì)粒。首先應(yīng)用帶有KPnⅠ和X

2、hoⅠ內(nèi)切酶雙酶切位點(diǎn)，并含有ACE2啟動(dòng)子片斷的引物對(duì)ACE2啟動(dòng)子進(jìn)行擴(kuò)增。我們選取了-2304至+48bp這一部分的啟動(dòng)子序列作為模板，通過設(shè)計(jì)不同的引物，將啟動(dòng)子序列逐段刪減，最終得到包含10段ACE2啟動(dòng)子序列的片斷，依次為:-2304至+48bp、-1799至+48bp、-1424至+48bp、-1236至+48bp、-1021至+48bp、-800至+48bP、-553至+48bP、-353至+48bp、-163至+48b

3、p的PGL3-ACE2載體。為進(jìn)一步獲得更小片段的啟動(dòng)子活性區(qū)域，我們又將-353到-163bp這一部分啟動(dòng)子序列細(xì)分為3個(gè)片段構(gòu)建PGL3-ACE2載體，依次為:-309至+48bp、-267至+48bP、-214至+48bp。
　　2.對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染與刺激
　　將2ug含有ACE2啟動(dòng)子片斷的pGL3-baisc質(zhì)粒就以及pGL3-basic質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)hela細(xì)胞中，在AngⅡ(10-7 M)刺激狀態(tài)下培養(yǎng)24小時(shí)，進(jìn)行下

4、一步實(shí)驗(yàn)。
　　3.實(shí)時(shí)定量聚合奠鏈反應(yīng)(RT-PCR)
　　通過RNA提取，逆轉(zhuǎn)錄和RT-PCR的方法對(duì)hela細(xì)胞內(nèi)β-actin、熒光素酶ACE2等基因的mRNA進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果：
　　1.ACE2啟動(dòng)子活性區(qū)域的鑒定
　　我們用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將含有ACE2啟動(dòng)子片斷的PGL3-basic報(bào)告載體轉(zhuǎn)入hela細(xì)胞中，在AngⅡ刺激下，用RT-PCR的方法檢測(cè)PGL3-basic報(bào)告載體上熒光素酶

5、的表達(dá)。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了含有-163至+48bp啟動(dòng)子片斷的載體后，熒光素酶的表達(dá)明顯下降。將進(jìn)一步縮短的啟動(dòng)子片段PGL3-basic報(bào)告載體轉(zhuǎn)染hela細(xì)胞，再次檢測(cè)熒光素酶的表達(dá)發(fā)現(xiàn)ACE2啟動(dòng)子活性區(qū)域位于-214到-163bp之間。
　　2.NKRF及C/EBP-β與ACE2啟動(dòng)子的結(jié)合
　　以ACE2啟動(dòng)子-214到-163bp段作為探針，經(jīng)與核蛋白孵育結(jié)合后，將DNA-蛋白復(fù)合物進(jìn)行LC-MS/MS檢測(cè)。經(jīng)LC-

6、MS/MS篩選出5個(gè)可能的轉(zhuǎn)錄因子，即NF-κB抑制因子(NKRF)、高遷移族蛋白轉(zhuǎn)錄因子(BBX)、鋅脂蛋白189、嗜鉻粒蛋白A、C/EBP-β。分別將這5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的siRNA連同pGL3-214報(bào)告載體一起轉(zhuǎn)染hela細(xì)胞后，RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)干擾NKRF和C/EBP-β可明顯降低熒光素酶的表達(dá);同時(shí)，將這5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的siRNA轉(zhuǎn)染人平滑肌細(xì)胞，干擾NKRF和C/EBP-β可顯著降低ACE2 mRNA及蛋白的表達(dá)。在提取的人平

7、滑肌細(xì)胞核蛋白中，用抗NKRF及C/EBP-β抗體免疫共沉淀下與之結(jié)合的DNA片段，用包含ACE2啟動(dòng)子-306至-144片斷的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，可見清晰的PCR條帶。同時(shí)，用siRNA干擾NKRF或C/EBP-β皆可導(dǎo)致二者中另外一個(gè)因子與ACE2啟動(dòng)子DNA序列結(jié)合能力下降。Co-IP也提示NKRF與C/EBP-β可相互結(jié)合。
　　3.動(dòng)物一般情況
　　兩部分動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中各組小鼠間體重及血脂水平?jīng)]有顯著差別。
　

8、　結(jié)論：
　　(1)ACE2啟動(dòng)子活性區(qū)域位于-214到-163之間，NKRF和C/EBP-β共同參與調(diào)控ACE2的表達(dá);
　　(2)在ApoE-/-小鼠易損斑塊模型中，過表達(dá)NKRF和C/EBP-β可上調(diào)斑塊內(nèi)ACE2的表達(dá)，進(jìn)而增加斑塊的穩(wěn)定性;
　　(3)單獨(dú)NKRF或C/EBP-β過表達(dá)增加斑塊穩(wěn)定性的機(jī)制還涉及抑制MMP2、MMP9及炎癥因子的表達(dá)。
　　論文Ⅱ 血管緊張素Ⅳ對(duì)腹主動(dòng)脈瘤的影響和機(jī)制研究

9、
　　目的：
　　(1)在ApoE-/-小鼠中構(gòu)建AngⅡ誘導(dǎo)的AAA模型;
　　(2)觀察不同劑量的AngⅣ在AngⅡ所誘導(dǎo)的ApoE-/-小鼠AAA中的作用;
　　(3)探討AngⅣ減少AAA形成的分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.動(dòng)物模型的建立
　　動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分為三部分。
　　第一部分:探討不同劑量的AngⅣ對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的AAA的影響。選取6-8周齡雄性ApoE-/-小鼠100只，高脂

10、飲食喂養(yǎng)8周。在第4周，將不同試劑裝入植入式膠囊滲透壓泵中，然后將滲透壓泵埋藏于小鼠皮下，持續(xù)恒速泵入28天。根據(jù)所給試劑的不同，將小鼠隨機(jī)分為5組（每組20只）:對(duì)照組（生理鹽水），未干預(yù)組(AngⅡ1.44mg/kg/d)，小劑量AngⅣ組(AngⅡ1.44 mg/kg/d+ AngⅣ0.72 mg/kg/d)，中劑量AngⅣ組(AngⅡ1.44 mg/kg/d+ AngⅣ1.44 mg/kg/d)，大劑量AngⅣ組(AngⅡ1.4

11、4 mg/kg/d+ AngⅣ2.88 mg/kg/d)。28天后，小鼠予以安樂死。
　　第二部分:應(yīng)用AT4R拮抗劑Divalinal-AngⅣ探討中劑量AngⅣ對(duì)AAA的作用是否由AT4R介導(dǎo)。選取6-8周齡雄性ApoE-/-小鼠60只，高脂飲食喂養(yǎng)8周。在第4周，將不同試劑裝入植入式膠囊滲透壓泵中，然后將滲透壓泵埋藏于小鼠皮下，持續(xù)恒速泵入28天。根據(jù)所給試劑的不同，將小鼠隨機(jī)分為3組（每組20只）:未干預(yù)組（AngⅡ1.4

12、4 mg/kg/d），中劑量AngⅣ組(AngⅡ1.44mg/kg/d+ AngⅣ1.44 mg/kg/d), Divalinal-AngⅣ組(AngⅡ1.44 mg/kg/d+AngⅣ1.44 mg/kg/d+divalinal-AngⅣ1.44 mg/kg/d)。28天后，小鼠予以安樂死。
　　第三部分:進(jìn)一步研究在沒有AngⅡ刺激狀態(tài)下，單獨(dú)應(yīng)用不同劑量的AngⅣ對(duì)AAA的影響。選取6-8周齡雄性ApoE-/-小鼠80只，高

13、脂飲食喂養(yǎng)8周。在第4周，將不同試劑裝入植入式膠囊滲透壓泵中，然后將滲透壓泵埋藏于小鼠皮下，持續(xù)恒速泵入28天。根據(jù)所給試劑的不同，將小鼠隨機(jī)分為4組（每組20只）:對(duì)照組（生理鹽水），小劑量AngⅣ組(AngⅣ0.72 mg/kg/d)，中劑量AngⅣ組(AngⅣ1.44 mg/kg/d)，大劑量AngⅣ組(AngⅣ2.88 mg/kg/d)。28天后，小鼠予以安樂死。
　　2.血壓測(cè)量
　　所有ApoE-/-小鼠在干預(yù)前

14、及干預(yù)后每周末，利用小鼠鼠尾測(cè)壓儀進(jìn)行血壓測(cè)量，對(duì)每只實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行3次血壓測(cè)量，取其血壓平均值作為最終數(shù)值。
　　3.組織病理學(xué)檢測(cè)
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將所有ApoE-/-小鼠予以安樂死，留取腹主動(dòng)脈標(biāo)本，并測(cè)量腹主動(dòng)脈（腎動(dòng)脈以上部位）的最大直徑，AAA定義為腹主動(dòng)脈最大直徑超過正常腹主動(dòng)脈直徑的50％，觀察AAA的形成率。制備腹主動(dòng)脈冰凍切片，厚度為5μm，進(jìn)行H&E染色、Verhoeff彈力纖維染色及Masson三色染色

15、;腎上段腹主動(dòng)脈組織內(nèi)MOMA-2、α SM-actin、MCP-1、IL-6、MMP-2和MMP-9的含量用免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果：
　　1.ApoE-/-小鼠血壓變化
　　與對(duì)照組相比，其余各組小鼠收縮壓均顯著升高，不同劑量的AngⅣ及divalinal-AngⅣ對(duì)收縮壓無明顯影響。
　　2.不同劑量AngⅣ對(duì)AAA形成的影響
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)照組、未干預(yù)組、小劑量AngⅣ、中劑量Ang

16、Ⅳ、大劑量AngⅣ組AAA的發(fā)生率分別為0％、87.5％、66.7％、37.5％、83.3％。與未干預(yù)組相比，中劑量AngⅣ可顯著降低AAA的發(fā)生率及腹主動(dòng)脈的最大直徑，而大劑量AngⅣ無明顯保護(hù)作用。與中劑量AngⅣ相比，大劑量AngⅣ處理可顯著增加AAA的發(fā)生率及腹主動(dòng)脈的最大直徑。
　　在無AngⅡ刺激前提下，小、中、大劑量AngⅣ組均沒有AAA的形成，并且三個(gè)組腹主動(dòng)脈最大直徑與對(duì)照組沒有顯著差別。
　　3.H&E和

17、Verhoff彈力纖維染色
　　AAA動(dòng)脈管壁內(nèi)可見彈力纖維斷裂、中斷，管壁變薄，呈瘤樣擴(kuò)張，外膜增生肥厚，管腔內(nèi)可伴有血栓形成。中劑量AngⅣ處理部分逆轉(zhuǎn)了AngⅡ所誘導(dǎo)的動(dòng)脈管壁組織學(xué)的病理變化;大劑量AngⅣ組動(dòng)脈管壁組織學(xué)改變與未干預(yù)組無明顯差別。
　　結(jié)論：
　　(1)AngⅣ對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的AAA發(fā)揮雙向作用，最佳劑量的AngⅣ可減少AAA的形成;
　　(2)AngⅣ對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的AAA的保護(hù)機(jī)制包