li-Key和PEP-1攜帶異種病毒表位嵌合疫苗的構(gòu)建及其體液免疫效應(yīng).pdf

1、跨膜糖蛋白恒定鏈（invaria nt china, Ii）在抗原遞呈細(xì)胞內(nèi)主要參與主要組織相容性復(fù)合體（MHC）Ⅱ類分子與抗原肽復(fù)合物的裝配，其關(guān)鍵活性基團(tuán)（Ii-Key）在此過程中發(fā)揮重要作用。近些年，Ii-Key已被證實(shí)能夠攜帶單一抗原或抗原肽，有效增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫。PEP-1是一種人工設(shè)計(jì)的細(xì)胞膜穿透肽（Cell penetrating peptide, CPP），具有克服細(xì)胞膜的屏障作用跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)能力，以非能量、非受體依賴

2、性的方式把蛋白質(zhì)、肽段、寡核苷酸等跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)入各種細(xì)胞的胞漿和胞核內(nèi)。本文基于Ii-Key和PEP-1載體上構(gòu)建異源多表位串聯(lián)肽新型疫苗，為雙重防控雞傳染性法氏囊?。↖nfectious Bursal Disease，IBD）和新城疫（Newcastle disease, ND）提供參考。
　　首先，本文構(gòu)建了Ii-Key與雞傳染性法氏囊病病毒VP2肽表位（aa197-209）和新城疫病毒HN肽表位（aa345-353）的嵌合體，并

3、將嵌合體基因插入pET-32a原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化E.coli Rose tta通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，用鎳柱親和層析純化融合蛋白，免疫SPF級(jí)BAL b/c小鼠，分別通過間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和免疫印記試驗(yàn)檢測(cè)小鼠體內(nèi)的抗體水平和融合蛋白的反應(yīng)原性。結(jié)果表明，與VP2/HN串聯(lián)表位對(duì)照組相比較，Ii-Key/VP2/HN嵌合體疫苗處理組抗體效價(jià)平均提高了13.7倍。
　　其次，將PEP-1和PEP-1-Ii-Key串聯(lián)載體分別與VP2

4、/HN表位連接構(gòu)建嵌合體（PEP-1/VP2/HN和PEP-1-Ii-Key/VP2/HN），通過原核表達(dá)，融合蛋白的純化，小鼠免疫和間接-ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)等方法，研究PEP-1和PEP-1-Ii-Key聯(lián)合載體對(duì)VP2/HN串聯(lián)肽免疫效應(yīng)的影響。結(jié)果表明，與單純VP2/HN串聯(lián)肽組相比，均能有效刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體（8.6和6.7倍，p<0.05）。但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，PEP-1-Ii-Key聯(lián)合載體免疫增強(qiáng)效應(yīng)明顯低于Ii-Key載體組

5、（p<0.05），表明PEP-1對(duì)Ii-Key免疫增強(qiáng)效應(yīng)發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用。
　　為了探究Ii-Key和PEP-1免疫增效作用是否與MHCⅡ類分子相互作用的加強(qiáng)有關(guān)，本文在構(gòu)建的原核重組質(zhì)?；A(chǔ)上，構(gòu)建了真核表達(dá)載體 pmCherry-C1與VP2/HN、Ii-Key/VP2/HN、PEP-1/VP2/HN、PEP-1/Ii-Key/VP2/HN真核重組質(zhì)粒，與實(shí)驗(yàn)室保存的pEGFP-N1-MHCⅡα真核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5

6、α，使用無內(nèi)毒質(zhì)粒抽提試劑盒抽提后取適量重組質(zhì)粒通過脂質(zhì)體Lipofectamine TM2000轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24h后使用激光共聚焦顯微鏡下觀察定位情況。結(jié)果表明，各處理組均能在胞內(nèi)與MHCⅡ類分子發(fā)生共定位，但是各組間差異不明顯。表明Ii-Key和PEP-1免疫增效作用與其是否增加了VP2/HN表位肽與MHCⅡ的相互作用沒有明顯關(guān)聯(lián)。
　　綜上所述，本文成功構(gòu)建了VP2/HN與Ii-Key或PEP-1嵌合體，發(fā)現(xiàn)單個(gè)載