異種VEGF基因重組T7噬菌體疫苗的構(gòu)建及其抗腫瘤效應(yīng)的初步研究.pdf

1、背景與目的：腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移與瘤區(qū)的血管有密切關(guān)系，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)是已知作用最強(qiáng)，最專(zhuān)一的促血管生成因子。VEGF由于mRNA剪接的不同，而存在5個(gè)亞型：VEGF121、VEGF165、VEGF189、VEGF206、VEGF145。其中VEGF165是刺激內(nèi)皮細(xì)胞增生最強(qiáng)有力的因子。用單克隆抗體封閉VEGF與受體結(jié)合，抑制腫瘤血管新生實(shí)現(xiàn)腫瘤治療取得了臨床有

2、效的結(jié)果。用于治療腫瘤的抗體，既可以用外源性抗體，亦可以用抗原免疫在體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生內(nèi)源性抗體。腫瘤疫苗作為腫瘤的特異性主動(dòng)免疫治療，其誘導(dǎo)機(jī)體特異性主動(dòng)免疫應(yīng)答、增強(qiáng)機(jī)體抗瘤能力的作用在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得到肯定，許多疫苗已進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)研究。噬菌體展示技術(shù)具有特異的基因-蛋白耦連機(jī)制，以其來(lái)制備重組疫苗，兼具DNA疫苗和蛋白疫苗的優(yōu)勢(shì)，既可以在基因水平把握某一蛋白的立體構(gòu)型，又可以對(duì)其DNA序列進(jìn)行各式各樣的修飾，并在其展示過(guò)程中進(jìn)行蛋白水平檢測(cè)

3、，有利于方便、快捷、有效地將基因的序列分析與蛋白的功能研究相結(jié)合。T7噬菌體勿須分泌到周質(zhì)或胞外，且操作簡(jiǎn)便、容易培養(yǎng)、生長(zhǎng)迅速、系統(tǒng)穩(wěn)定，而且是一種小型噬菌體，抗原直接展示在其外殼上，作為載體是合適的。本實(shí)驗(yàn)選取了T7select10-3b噬菌體載體來(lái)展示外源肽段：T7Select10-3b的P10B可融合小于1200aa的外源肽段(5～15個(gè)拷貝/噬菌體)，將人源VEGF165(相對(duì)于鼠源VEGF164同源性為89％)，克隆到T7噬

4、菌體基因組中，使其與P10B融合，構(gòu)建人VEGF基因重組T7噬菌體疫苗。用其免疫荷Lewis肺癌C57BL/6J小鼠動(dòng)物模型，以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生內(nèi)源性抗VEGF抗體，觀察其抗腫瘤效果。 方法：用PrimerPremier5.0軟件根據(jù)VEGF基因序列，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增VEGFmRNA全片段。用RT-PCR方法從人肺癌組織總RNA中克隆出VEGF基因片段，將其克隆到載體pMD18-TVector上，并轉(zhuǎn)化E.coliDH5a感受態(tài)細(xì)胞，從

5、陽(yáng)性克隆中提取質(zhì)粒，對(duì)該基因片段進(jìn)行測(cè)序。將引物引入EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)，將PCR擴(kuò)增的片段克隆到T7噬菌體上。人VEGF展示于其衣殼次要頭蛋白(P10B)上，構(gòu)建了人VEGF基因重組T7噬菌體疫苗。用該重組噬菌體侵染其宿主菌BLT5403，液體擴(kuò)增并純化出重組噬菌體疫苗制備噬菌體效價(jià)達(dá)到1×1013pfu/ml。經(jīng)SDS-PAGE及WesternBlot抗原性檢測(cè)，確認(rèn)T7select10-3b-VEGF融合蛋白的表達(dá)情況及

6、其VEGF抗原性。將C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為三組，每組7只：T7-VEGF疫苗組、空白噬菌體組(T7)、生理鹽水組(NS)。將各組樣品與等體積弗氏佐劑混合，各組小鼠每周免疫0.2ml/只(1×1012pfu/只)重組噬菌體疫苗、空白噬菌體、生理鹽水，共免疫四周。免疫四周后，右上肢腋下接種純系Lewis肺癌細(xì)胞4×106，建立C57BL/6J純系小鼠Lewis肺癌動(dòng)物模型。觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況和小鼠狀態(tài)，在腫瘤可見(jiàn)后，每隔一天用游標(biāo)卡尺

7、測(cè)量腫瘤大小，并繪制生長(zhǎng)曲線。14d后處死小鼠小心分離瘤體并稱(chēng)重。用ELISA法檢測(cè)各組小鼠血清特異性抗VEGF抗體滴度。實(shí)驗(yàn)治療組與空白噬菌體對(duì)照組、生理鹽水對(duì)照組瘤體均重采用單因素方差分析(ANOVA)，兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)，觀察各實(shí)驗(yàn)治療組的抗腫瘤效果。 結(jié)果：人肺癌組織總RNA的RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)目標(biāo)條帶位置正確。從轉(zhuǎn)化的克隆株中挑取陽(yáng)性克隆，經(jīng)質(zhì)粒提取和測(cè)序，確認(rèn)成功克隆了VEGF基因。T7

8、select10-3-VEGF基因用噬菌體臂上引物作PCR，經(jīng)測(cè)序顯示VEGF基因成功克隆到T7噬菌體基因組中。SDS-PAGE及WesternBlot抗原性檢測(cè)確認(rèn)，表達(dá)的VEGF-T7P10B融合蛋白具有VEGF抗原性，成功構(gòu)建了人VEGF基因重組T7噬菌體疫苗。并且成功建立了C57BL/6J純系小鼠Lewis肺癌動(dòng)物模型，T7-VEGF疫苗組，T7組、生理鹽水組腫瘤均重分別為：0.543±0.259g、0.982±0.359g、1