融合Lipo多肽的登革病毒四價(jià)疫苗的構(gòu)建及免疫效應(yīng)研究.pdf

1、登革病毒(Dengue virus，DENV)感染引起的登革熱是熱帶和亞熱帶國家和地區(qū)的重要公共衛(wèi)生問題。DENV主要通過伊蚊（包括埃及伊蚊和白紋伊蚊）的叮咬進(jìn)行傳播。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，全世界有超過36億人生活在登革熱流行區(qū)，每年感染DENV的人數(shù)超過5千萬，其中有近3萬人死亡。近年來，我國沿海的臺(tái)灣、福建、廣東、廣西和云南等均有登革熱的流行，并有向內(nèi)陸蔓延的趨勢。因此，急需研制一種安全、有效的登革疫苗用于預(yù)防登革熱的發(fā)生。
　　DE

2、NV包括4個(gè)血清型(DENV1、DENV2、DENV3、DENV4)，且各血清型病毒之間缺乏交叉保護(hù)。因此，理想的登革病毒疫苗應(yīng)是包含4個(gè)血清型病毒主要中和抗原的四價(jià)疫苗。登革病毒的包膜蛋白（E蛋白）是其主要的結(jié)構(gòu)蛋白，E蛋白不僅能和宿主細(xì)胞表面受體相互結(jié)合從而介導(dǎo)病毒的入侵，還能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體。E蛋白有3個(gè)結(jié)構(gòu)域(DⅠ，DⅡ，DⅢ)，其中DⅢ結(jié)構(gòu)域含有多個(gè)血清型特異的中和表位和宿主細(xì)胞受體識(shí)別位點(diǎn)，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生病毒型特異的中和抗

3、體，從而發(fā)揮免疫保護(hù)作用。因此，登革病毒EDⅢ被廣泛認(rèn)為是研制登革疫苗的最有效的候選抗原之一。但由于重組表達(dá)的EDⅢ缺乏較好的免疫效應(yīng)，阻礙了其后續(xù)的疫苗開發(fā)。因此，如何提高重組EDⅢ的免疫效果是目前亟待解決的科學(xué)問題。
　　近年來，有研究發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體Lipo(liposome)和蛋白融合表達(dá)后可以有效提升目的蛋白的免疫效應(yīng)。例如，將Lipo多肽分別與DENV2和DENV4的EDⅢ融合表達(dá)后的重組蛋白能有效誘導(dǎo)特異性中和抗體的產(chǎn)生，

4、并能降低產(chǎn)生抗體依賴性增強(qiáng)(ADE)效應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，這為登革疫苗的研制提供了一種新的策略。考慮到登革病毒變異性強(qiáng)，即使是同一血清型的各流行株之間也存在抗原變異。而篩選各血清型中具有廣泛代表性EDⅢ保守序列將為研制有效的登革四價(jià)疫苗提供保障。因此，本研究擬首先通過生物信息學(xué)分析獲得具有廣泛代表性的登革病毒1-4型EDⅢ區(qū)的氨基酸序列;然后將Lipo多肽與篩選到的保守的登革病毒1-4型EDⅢ區(qū)進(jìn)行串聯(lián)融合，從而制備一種能同時(shí)針對登革病毒各血清型

5、和絕大多數(shù)流行株的登革四價(jià)重組疫苗，為登革熱的防控奠定基礎(chǔ)。
　　目的：
　　首先，篩選具有廣泛代表性的登革病毒1-4型EDⅢ區(qū)的氨基酸序列;然后，利用GS linker將篩選到的保守DENV1-4 EDⅢ序列與免疫佐劑Lipo多肽形成融合抗原LipoEDⅢ;基于LipoEDⅢ，分別構(gòu)建登革病毒四價(jià)的重組亞單位疫苗和甲病毒復(fù)制子疫苗，并在小鼠體內(nèi)研究這兩種候選疫苗的免疫效應(yīng)，從而為研制新型的登革病毒四價(jià)疫苗奠定理論基礎(chǔ)。

6、r>　　方法：
　　1.DENV EDⅢ區(qū)的生物信息學(xué)分析
　　通過對黃病毒數(shù)據(jù)庫FLAVIdB(http://cvc.dfci.harvard.edu/flavi/)收錄的1795條DENV1、1487條DENV2、1012條DENV3和407條DENV4 E蛋白分別進(jìn)行氨基酸序列的比對分析，得到氨基酸保守性在90％以上的DENV1-4型EDⅢ區(qū)序列作為候選靶抗原序列。
　　2.重組LipoEDⅢ蛋白的表達(dá)純化及鑒定

7、
　　將編碼Lipo多肽和DENV1-4型EDⅢ區(qū)的基因序列通過柔性氨基酸鏈GSlinker進(jìn)行連接，并插入到冷休克原核表達(dá)載體pColdⅢ的多克隆位點(diǎn)，得到重組質(zhì)粒pColdⅢ-LipoEDⅢ。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.Coli.DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，通過菌液PCR，雙酶切鑒定和測序分析獲得陽性克隆。
　　將重組質(zhì)粒pColdⅢ-LipoEDⅢ轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)細(xì)胞，通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳和Weste

8、rn blot鑒定目的蛋白LipoEDⅢ的表達(dá)。
　　采用鎳柱親和層析法純化目的蛋白，透析超濾濃縮獲得較高純度和濃度的重組LipoEDⅢ蛋白用于后續(xù)的免疫試驗(yàn)。
　　3.重組質(zhì)粒DREP-LipoEDⅢ的構(gòu)建
　　將LipoEDⅢ基因片段連接到甲病毒復(fù)制子載體DREP，將構(gòu)建的重組載體DREP-LipoEDⅢ轉(zhuǎn)化到E.Coli.DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，通過菌液PCR，雙酶切鑒定和測序分析獲得重組質(zhì)粒DREP-LipoED

9、Ⅲ。并將重組質(zhì)粒DREP-LipoEDⅢ轉(zhuǎn)染293細(xì)胞檢測目的蛋白LipoEDⅢ的表達(dá)。
　　4.LipoEDⅢ重組蛋白和甲病毒復(fù)制子疫苗的免疫試驗(yàn)
　　分別將純化的lipoEDⅢ蛋白和復(fù)制子DREP-LipoEDⅢ DNA免疫BABL/c小鼠，在第三次免疫后，采用ELISA法檢測LipoEDⅢ重組蛋白和DREP-LipoEDⅢ DNA免疫小鼠后多克隆抗體效價(jià)來評估其體液免疫效果。并通過檢測LipoEDⅢ重組蛋白刺激小鼠脾淋

10、巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子如IFN-γ、IL-4和IL-10等評估其細(xì)胞免疫效果。
　　結(jié)果：
　　1.利用生物信息學(xué)分析獲得了具有廣泛代表性的登革病毒1-4型EDⅢ序列，其氨基酸序列的保守性在各血清型中均達(dá)到90％以上。
　　2.成功構(gòu)建了融合lipo多肽和DENV1-4 EDⅢ區(qū)的原核表達(dá)載體pColdⅢ-LipoEDⅢ，經(jīng)過SDS-PAGE電泳和WB鑒定，融合蛋白LipoEDⅢ表達(dá)成功，并通過鎳離子親和層析法獲得較高純

11、度的重組蛋白。
　　3.成功構(gòu)建了基于甲病毒復(fù)制子的重組質(zhì)粒DREP-LipoEDⅢ，并轉(zhuǎn)染293細(xì)胞48h后，經(jīng)過SDS-PAGE電泳和Western blot鑒定，目的蛋白LipoEDⅢ成功表達(dá)。
　　4.分別以純化的LipoEDⅢ蛋白和DREP-LipoEDⅢ為抗原免疫小鼠。經(jīng)過三次免疫后，利用間接ELISA法檢測小鼠血清中抗體滴度，其中LipoEDⅢ蛋白免疫組小鼠的血清中抗體滴度可高達(dá)1∶40，000。而DREP-L

12、ipoEDⅢ免疫組的血清抗體效價(jià)較低為1∶160。
　　5.利用純化的LipoEDⅢ蛋白為抗原刺激免疫鼠脾中的淋巴細(xì)胞，通過雙抗體夾心ELISA檢測其分泌的細(xì)胞因子后發(fā)現(xiàn)，LipoEDⅢ重組蛋白免疫組細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10分別可達(dá)40pg/mL，8pg/mL和186pg/mL。DREP-LipoEDⅢ重組質(zhì)粒免疫組細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10分別可達(dá)66pg/mL，23pg/mL和118pg/mL。<

13、br>　　結(jié)論：
　　1.本研究在利用生物信息學(xué)分析獲得了登革病毒1-4型中具有廣泛代表性的EDⅢ序列的基礎(chǔ)上，通過GS linker將編碼免疫佐劑Lipo多肽與登革病毒1-4型包膜蛋白EDⅢ區(qū)進(jìn)行串聯(lián)融合從而獲得LipoEDⅢ基因，并將LipoEDⅢ基因分別克隆至pColdⅢ原核表達(dá)載體和甲病毒復(fù)制子DREP載體，進(jìn)而成功制備了LipoEDⅢ蛋白和DREP-LipoEDⅢ質(zhì)粒，將純化的LipoEDⅢ蛋白與DREP-LipoEDⅢ