應(yīng)用shotgun技術(shù)對旋毛蟲侵入相關(guān)蛋白的初步篩選.pdf

1、旋毛形線蟲[Trichinella spiralis(Owen,1835)Railliet,1895],簡稱旋毛蟲,是一種成蟲和幼蟲分別寄生在同一宿主的小腸和骨骼肌細胞內(nèi)的線蟲。旋毛蟲引起的旋毛蟲病(trichinellosis)是一種危害非常嚴重的食源性人獸共患寄生蟲病。當人或動物生食或半生食含旋毛蟲的肉類后,幼蟲在胃液的作用下被消化脫囊釋放出來,迅速進入小腸中的多細胞內(nèi)龕中。在感染性第一期幼蟲鉆入腸道柱狀上皮細胞內(nèi)龕后,稱之為旋毛蟲

2、腸道感染性第一期幼蟲(L1);經(jīng)29～36h完成4次蛻皮(L1～L4)后發(fā)育為成蟲,雌雄交配,96h后產(chǎn)出新生幼蟲,新生幼蟲經(jīng)血循環(huán)移行到肌肉組織,幼蟲在肌肉中可以生存數(shù)年而保持感染性。因此,脫囊幼蟲(腸道感染性第1期幼蟲)侵入腸粘膜內(nèi)繼續(xù)發(fā)育或是被宿主從腸道排出,是旋毛蟲能否導(dǎo)致宿主感染與致病的關(guān)鍵步驟。
　　 盡管旋毛蟲侵入腸上皮細胞的體外模型已建立,但是感染性幼蟲對腸上皮細胞的識別,侵入和移行的機制均不完全清楚。本研究模擬

3、旋毛蟲感染宿主的環(huán)境,將感染性幼蟲與小腸上皮細胞在體外共培養(yǎng),對培養(yǎng)前后的蟲體蛋白和細胞蛋白進行SDS-PAGE分離,聯(lián)合Western blot挑選出有差異的條帶,采用shotgun液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)進行鑒定,將質(zhì)譜分析得到的數(shù)據(jù)應(yīng)用SEQUEST軟件及數(shù)據(jù)庫搜索完成蛋白質(zhì)的鑒定,檢測旋毛蟲感染性幼蟲在侵入小腸上皮細胞前后蟲體蛋白和細胞蛋白的變化,并對鑒定出的蛋白質(zhì)從分子功能、生物學途徑、亞細胞定位三個方面進行GOA分類。幼蟲與細胞

4、接觸后早期表達的蛋白可能是其侵入的相關(guān)蛋白,幼蟲早期表達的蛋白抗原對本病的早期診斷也可能具有重要價值。這些研究將為更深入了解旋毛蟲侵入腸上皮細胞機制提供有力的數(shù)據(jù)支持和參考。
　　 材料與方法:
　　 1.旋毛蟲蟲種、實驗動物及細胞系本實驗所用的旋毛蟲為河南省南陽豬源旋毛蟲(Trichinella spiralis),由本室昆明小鼠傳代保種。20只雄性6周齡昆明小鼠(清潔級),體重20g～25g,均購自鄭州大學醫(yī)學院實驗

5、動物中心。人回盲腸癌細胞HCT-8[HRT-18]購于中國科學院細胞庫。
　　 2.旋毛蟲肌幼蟲的收集與激活將旋毛蟲肌幼蟲按照300條/只經(jīng)口感染50只昆明小鼠,42 d后脫頸椎處死。膈肌壓片鏡檢證實感染成功后,剝皮、除內(nèi)臟和脂肪,用攪拌器攪碎至肌肉完全攪碎。采用人工消化法消化4 h,按貝氏法收集肌幼蟲。將收集的肌幼蟲用含5％人膽汁的PBS在37℃5%CO2條件下孵育2～3 h,用PBS洗滌3次后,加入含抗生素的PBS中37℃孵

6、育1h備用。
　　 3.細胞培養(yǎng)將HCT-8細胞接種在RPMI-1640完全培養(yǎng)基中,在37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),2～3d即可形成致密的單細胞層,此時用于接種肌幼蟲。在接種前1d按照常規(guī)方法給細胞換液,以及時去除死細胞,保證細胞狀態(tài)良好。
　　 4.旋毛蟲蟲體蛋白和HCT-8細胞蛋白的SDS-PAGE分析及Western blot鑒定將激活的肌幼蟲與RPMI-1640培養(yǎng)基按5000條/ml的比例混合后加入長滿HCT-

7、8細胞的75ml培養(yǎng)瓶中,37℃5%CO2條件下培養(yǎng)18 h后,去除培養(yǎng)基與幼蟲,收集肌幼蟲,加入0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化后收集細胞,按比例分別加入RIPA裂解液提取蟲體蛋白和細胞蛋白。BCA法測得蟲體蛋白和細胞蛋白后,利用SDS-PAGE及蛋白質(zhì)印跡(Western blot)進行分析。
　　 5.LC-MS/MS分析根據(jù)Western blot的結(jié)果,比對膠上相匹配的差異條帶。用手術(shù)刀片將膠上差異部分切割下

8、來,胰酶酶解、抽提肽段。酶解后得到的肽段提取物使用LC-MS/MS系統(tǒng)進行分析,質(zhì)譜設(shè)備為Finnigan線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀LTQ,microspray模式。質(zhì)譜儀配置C-18反相色譜柱,流動相A相為0.1%溶于超純水的甲酸,B相為0.1%溶于乙睛水溶液中的甲酸。肽段混合物的洗脫梯度:2%～80%,洗脫時間60min,重復(fù)三次。串聯(lián)質(zhì)譜分析包括一個全掃描(fullMS scan)和十個串聯(lián)掃描(MS/MS scan)。
　　

9、6.質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析和處理數(shù)據(jù)搜索引擎為Bioworks version3.2software(SEQUSET,Thenno Electron)軟件進行數(shù)據(jù)庫搜索。肽段數(shù)據(jù)經(jīng)SEQUEST過濾、匹配,只有分值較高的肽段被保留。過濾參數(shù)為:當Charge+1,Xcorr≥1.9:當Charge+2,Xcorr≥2.2:當Charge+3,Xcorr≥3.75:其中DelCN≥0.1。最后得到胰酶消化的蛋白質(zhì)信息列表數(shù)據(jù)。
　　 7.I

10、nterPro注解和GO分類使用EXPASY工具在線分析蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)(包括分子量Mr、等電點pI等),最后用圖表進行展示。使用InterProscan軟件完成對蛋白序列的搜索。采用GO工具,從生物學途徑、亞細胞定位及分子功能三方面對蛋白質(zhì)表達譜進行功能分析及分類,并通過WEGO在線分析展示各部分分布。
　　 結(jié)果:
　　 1.幼蟲與HCT-8細胞培養(yǎng)后蟲體蛋白的SDS-PAGE與Western blot分析SDS

11、-PAGE結(jié)果表明,在培養(yǎng)基中培養(yǎng)18h的蟲體抗原有41條蛋白帶。HCT-8細胞與幼蟲培養(yǎng)后的蟲體蛋白增加了9條蛋白帶(15、29、31、35、37、58、69、121和132 kDa),減少了4條蛋白帶(12、17、40、51 kDa)。Western blot結(jié)果顯示,幼蟲在培養(yǎng)基中孵育18h后蟲體蛋白能夠被旋毛蟲感染鼠血清識別的有18條帶,分子量范圍為18 kDa～135 kDa,幼蟲和HCT-8細胞孵育后與僅在培養(yǎng)基中孵育的幼蟲

12、相比,被旋毛蟲感染鼠血清多識別了7條蛋白帶(21、28、30、36、58、77和123 kDa),少識別了3條蛋白帶(23、51、97 kDa)。
　　 2.LC-MS/MS分析和鑒定旋毛蟲幼蟲蛋白旋毛蟲感染性幼蟲和HCT-8細胞共孵育后,被感染旋毛蟲鼠血清識別的3條蛋白帶被從膠上切離下來,分子量分別為21、36及58 kDa。應(yīng)用shotgun LC-MS/MS和生物信息學分析,共有211個非冗余蛋白質(zhì)被鑒定出來。在高可信度蛋

13、白質(zhì)當中,有67.8%的蛋白相對分子量范圍為20 kDa～65 kDa。對于等電點來說,有123種(58.3%)蛋白質(zhì)的等電點范圍為4～7,58種(28.9%)蛋白的等電點范圍為8～10。少于8.5%的蛋白等電點范圍為7～8,10種(3.8%)蛋白質(zhì)具有較高的等電點(大于10)。
　　 3.旋毛蟲幼蟲蛋白根據(jù)GO進行功能分類對鑒定出的旋毛蟲的211種蛋白,利用GO工具,從生物學過程、分子功能和細胞定位三個方面進行分類。旋毛蟲蛋白

14、的分子功能共分為10大類,其中催化活性(75種蛋白,17.5%)和蛋白結(jié)合(110種蛋白,25.6%)是兩大主要功能。大部分的細胞和代謝過程與大分子的合成和降解有關(guān),尤其是糖類,核苷酸和蛋白可能是感染性幼蟲在發(fā)育和生長過程中釋放出來的。在211種蛋白中,139種蛋白位于細胞中,105種位于細胞器中。
　　 4.HCT-8細胞與幼蟲培養(yǎng)后細胞蛋白的SDS-PAGE與Western blot分析SDS-PAGE結(jié)果表明,正常的HCT

15、-8細胞有44條蛋白帶。HCT-8細胞與幼蟲培養(yǎng)后的細胞蛋白與正常HCT-8細胞蛋白相比增加了5條蛋白帶(19、34、61、128和132 kDa),減少了1條蛋白帶(118 kDa)。Western blot結(jié)果顯示,正常HCT-8細胞的蛋白能夠被旋毛蟲感染鼠血清識別的有5條帶,分子量范圍為30～129 kDa;HCT-8細胞與幼蟲培養(yǎng)后與培養(yǎng)前的HCT-8細胞相比,被旋毛蟲感染鼠血清多識別了4條蛋白帶(24、35、61和115 kD

16、a)。
　　 5.LC-MS/MS分析HCT-8細胞蛋白HCT-8細胞與幼蟲共孵育后,被旋毛蟲感染鼠血清多識別的細胞蛋白的分子量分別為24、35、61 kDa,將這3條蛋白帶通過shotgun LC-MS/MS進行進一步分析。共有64種非冗余蛋白被鑒定出來。有43種蛋白(67.2%)分子量范圍分布在10～70 kDa。等電點的范圍為4.7～10.92,其中有26種蛋白(40.6%)的等電點在5～6。
　　 6.HCT-8

17、細胞與幼蟲共孵育后增加的蛋白通過GO進行基因分類利用GO工具,64種非冗余蛋白中共有54種蛋白質(zhì)的功能已知。腸上皮細胞與幼蟲共孵育后細胞中的旋毛蟲蛋白有注解的與細胞成分有關(guān)。其中46種蛋白在細胞中,35種在細胞器中。根據(jù)GO的分子功能分類,共可分為7大類,其中結(jié)合功能(43,79.6%)和催化活性(23,42.6%)仍然是兩大主要功能。大部分的蛋白參與了生物進程,主要是細胞過程、新陳代謝、生物進程的調(diào)控及應(yīng)激和信號傳導(dǎo)。
　　

18、結(jié)論:
　　 1.旋毛蟲幼蟲與HCT-8細胞培養(yǎng)后,被感染鼠血清多識別的7條蟲體蛋白帶(21、28、30、36、58、77和123 kDa)可能是幼蟲與細胞接觸后分泌的新蛋白;少識別的3條蛋白帶(23、51、97 kDa)可能是被HCT-8細胞釋放的蛋白酶水解掉的蟲體蛋白或是蟲體發(fā)育過程中期特異性蛋白的改變。
　　 2.HCT-8細胞與旋毛蟲幼蟲與培養(yǎng)后,被感染鼠血清多識別的4條細胞蛋白帶(24、35、61和115 kD