旋毛蟲組織蛋白酶F的功能鑒定及藥物靶標(biāo)篩選.pdf

1、旋毛蟲病是由旋毛蟲感染引起，是一種再度肆虐流行的疾病，旋毛蟲肌幼蟲入侵宿主且形成適應(yīng)厭氧環(huán)境的包囊，這可能是旋毛蟲的正選擇基因以及旋毛蟲基因組與其余線蟲基因組中存在差異基因而導(dǎo)致。正選擇基因在進(jìn)化中具有非同義替代率高于同義替代率的特性，可通過(guò)已存在的基因隨意突變而改變基因功能，從而使寄生蟲適應(yīng)宿主環(huán)境，此外旋毛蟲基因組與其余基因組存在差異也可能是旋毛蟲適應(yīng)宿主環(huán)境的另外一種機(jī)制,因此本研究分析了旋毛蟲與不同的蠕蟲物種之間的部分差異基因和

2、正選擇基因。
　　半胱氨酸蛋白酶是寄生性蠕蟲的重要毒力因子，可能作為一潛在抗蠕蟲藥物靶標(biāo)和疫苗候選抗原。旋毛蟲通過(guò)機(jī)械作用、酶水解來(lái)入侵宿主肌纖維，半胱氨酸蛋白酶是否在入侵中具有作用，仍屬未知。組織蛋白酶F屬于半胱氨酸蛋白酶家族，旋毛蟲組織蛋白酶F在NCBI中初步篩選顯示在旋毛蟲中是多基因家族，其生物學(xué)特性未知，因此我們對(duì)旋毛蟲組織蛋白酶F家族基因進(jìn)行研究。
　　本研究以旋毛蟲基因組與馬來(lái)絲蟲、豬鞭蟲、錫蘭鉤口線蟲和秀麗隱桿

3、線蟲基因組作為對(duì)照，采用CODEML軟件鑒定旋毛蟲的正選擇基因,結(jié)果顯示鑒定出986個(gè)正選擇基因，旋毛蟲正選擇基因可解釋其對(duì)宿主厭氧環(huán)境的適應(yīng)性，鑒定的正選擇基因?qū)τ谒幬锖鸵呙缪邪l(fā)具有潛在作用；采用blastn進(jìn)行差異基因組研究,將旋毛蟲與人類、錫蘭溝口線蟲、廣州管圓線蟲、羅阿線蟲、豬蛔蟲、美洲板口線蟲、馬來(lái)絲蟲、彭亨氏線蟲、犬弓首蛔蟲、秀麗小桿線蟲、秀麗隱桿線蟲、鼠鞭蟲、犬惡心絲蟲、豬鞭蟲、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲、人鞭蟲、棘球蚴、曼氏血吸蟲中的

4、半胱氨酸蛋白酶家族進(jìn)行比較，結(jié)果顯示組織蛋白酶F、組織蛋白酶B、組織蛋白酶L、腸道特異性半胱氨酸蛋白酶、二肽基肽酶在不同物種之間存在差異。成功克隆了TsCF1、TsCF2、TsCF3基因， TsCF1、TsCF2、TsCF3基因片段分別編碼366 aa、496 aa和365 aa。將去除信號(hào)肽基因與pET30a表達(dá)載體連接得到重組質(zhì)粒隨后進(jìn)行原核表達(dá)，表達(dá)獲得的重組蛋白分別大小為TsCF1重組蛋白大小為45.00 kDa, TsCF2重

5、組蛋白大小為58.29 kDa, TsCF3重組蛋白大小為43.94 kDa。將純化的rTsCF1、rTsCF2和rTsCF3免疫家兔后，獲高免血清。免疫印跡實(shí)驗(yàn)顯示TsCF1、TsCF2和TsCF3在旋毛蟲肌幼蟲粗抗原、排泄分泌抗原以及成蟲粗抗原中均存在；免疫組化顯示TsCF1定位于表皮和桿狀體、TsCF2定位于生殖原基、TsCF3定位于后腸、表皮和桿狀體中?？贵w阻斷實(shí)驗(yàn)顯示與對(duì)照組相比，經(jīng)TsCF1、TsCF2和TsCF3抗血清處理

6、過(guò)的肌幼蟲攻擊小鼠35天后，肌幼蟲減蟲率分別為54.38％、23%和48%，經(jīng)TsCF1、TsCF2和TsCF3抗血清處理過(guò)的肌幼蟲攻擊小鼠5天后TsCF1、TsCF2和TsCF3組與對(duì)照組相比成蟲減蟲率分別為62.5%、50.6%和55.67%，顯示TsCF1、TsCF2和TsCF3對(duì)蟲體生存具有顯著作用，推測(cè)TsCF家族蛋白具有胚胎致死性；采用TsCF1、TsCF2、TsCF3和TsCF1、TsCF2、TsCF3混合蛋白進(jìn)行免疫,在

7、最后一次免疫后2周進(jìn)行攻蟲實(shí)驗(yàn)，與對(duì)照組相比，上述各組的減蟲率分別為23.24%、21.28%、23.29%和51.72%。將rTsCF1、rTsCF2和rTsCF3復(fù)性后，采用針對(duì)組織蛋白酶F的特異性底物Z-Phe-Arg-AMC研究重組TsCF1和TsCF2在pH為5.5時(shí)的酶活性實(shí)驗(yàn)和抑制實(shí)驗(yàn)，顯示rTsCF1的Km為0.5091μM， Vmax為6.12 RFU/sμM，E64可強(qiáng)有效抑制rTsCF1活性，其IC50為135.5

8、0±16.90 nM；rTsCF2的Km為2.016μM，最大速度Vmax值為5.72 RFU/sμM, E64也可強(qiáng)有效抑制rTsCF2活性，其IC50值為112.50±6.16 nM；rTsCF3無(wú)酶活性。通過(guò)虛擬對(duì)接實(shí)驗(yàn)研究了TsCF1、TsCF2、TsCF3 與E64和K11777之間的相互作用，將旋毛蟲組織蛋白酶F家族與cystatin家族進(jìn)行虛擬對(duì)接，獲得組織蛋白酶F家族與cystatin家族之間的最適結(jié)合構(gòu)象，顯

9、示cystatin家族可與組織蛋白酶F家族之間進(jìn)行結(jié)合，這部分解釋了cystatin家族和組織蛋白酶F家族之間的抑制作用。將旋毛蟲組織蛋白酶F家族與FDA藥物庫(kù)和天然代謝產(chǎn)物庫(kù)進(jìn)行對(duì)接和虛擬篩選，每個(gè)組織蛋白酶F均獲得200種化合物。采用SPRi技術(shù)對(duì)TsCF1進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示TsCF1與頭孢地尼、呋塞米、酮洛芬、地拉羅司、舒洛芬、曲尼斯特、坎地沙坦、纈沙坦、替米考星、鹽酸倍他洛爾、阿奇霉素、鹽酸奎寧二水合物、阿奇霉素二水合物可特異性