旋毛蟲(chóng)絲氨酸蛋白酶抑制劑的表達(dá)及活性分析.pdf

1、旋毛蟲(chóng)病是由旋毛蟲(chóng)引起的一種重要的食源性寄生蟲(chóng)病。旋毛蟲(chóng)能夠感染人、豬、犬、貓、鼠、虎、狼等150多種動(dòng)物。人感染旋毛蟲(chóng)主要表現(xiàn)為發(fā)熱、肌肉酸痛、腹瀉、水腫、皮疹、代謝紊亂、出血等;還可能導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)的并發(fā)癥;嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡?；疾?dòng)物臨床表現(xiàn)分為腸期和肌期，腸期在病豬主要表現(xiàn)為急性卡他性腸炎，而肌期主要表現(xiàn)為病豬、病牛發(fā)生發(fā)熱、運(yùn)動(dòng)障礙、呼吸困難等全身癥狀，最后導(dǎo)致死亡;病豬耐過(guò)后，臨床癥狀可以減輕而呈帶蟲(chóng)狀態(tài)。

2、在整個(gè)生命周期中，旋毛蟲(chóng)一直暴露于宿主胃、小腸的消化酶以及體液的免疫酶環(huán)境中。而證據(jù)顯示多種腸道線蟲(chóng)分泌的蛋白酶抑制劑能夠減小這種宿主內(nèi)環(huán)境中消化酶對(duì)其導(dǎo)致的損傷，同時(shí)，也能夠輔助寄生性線蟲(chóng)吸收營(yíng)養(yǎng)并抵抗宿主的免疫反應(yīng)。而絲氨酸蛋白酶抑制劑在這些蛋白酶抑制劑中占有重要地位。
　　絲氨酸蛋白酶抑制劑能夠抑制一種或多種蛋白酶，它在動(dòng)物、植物、寄生蟲(chóng)、病毒等的生存、繁殖發(fā)揮著重要作用。到目前為止，已經(jīng)從多種寄生蟲(chóng)，如血吸蟲(chóng)、鞭蟲(chóng)、鉤蟲(chóng)、

3、絳蟲(chóng)和其他寄生蟲(chóng)體內(nèi)分離并鑒定了絲氨酸蛋白酶抑制劑。這些研究表明，絲氨酸蛋白酶抑制劑在保護(hù)線蟲(chóng)免受宿主蛋白酶的消化作用以及與宿主相應(yīng)蛋白結(jié)合而調(diào)節(jié)宿主的免疫炎癥反應(yīng)。這些絲氨酸蛋白酶抑制劑的能夠抑制酶的活性，包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、胰彈性蛋白酶以及中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶等。根據(jù)絲氨酸蛋白酶抑制劑的序列、結(jié)構(gòu)特征以及作用機(jī)制，將其分成至少18個(gè)，如kunitz、kazal、Serpin、TAP以及TIL家族。
　　本研究從G

4、enBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得Tsp03044、TspAd5、Tsp03548(登錄號(hào):XM_003379333、EU263307、XM_003379851)的全長(zhǎng)序列，并采用各種生物信息學(xué)軟件對(duì)其基本理化性質(zhì)、跨膜區(qū)、信號(hào)肽、二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)化地位等進(jìn)行了詳細(xì)分析。結(jié)合蛋白跨膜區(qū)、信號(hào)肽預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)Tsp03044、TspAd5、Tsp03548三種蛋白質(zhì)均可能是分泌蛋白，并分別具有典型的Ascaris、Serpin、Kazal型結(jié)構(gòu)域，分別屬于As

5、caris、Serpin、Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑;同時(shí)，還根據(jù)各自家族的典型結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)了三種蛋白質(zhì)的重要的作用位點(diǎn)。另外，通過(guò)對(duì)Tsp03044、TspAd5、Tsp03548的進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn):三種蛋白與各自家族成員有較高的同源性，在整體的進(jìn)化分支上分別與線蟲(chóng)的絲氨酸蛋白酶抑制劑關(guān)系較近。
　　本研究設(shè)計(jì)并合成了擴(kuò)增Tsp0304基因的引物，由旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)基因組中擴(kuò)增出Tsp03044基因，測(cè)序正確后將其連接至載體內(nèi)，構(gòu)

6、建出帶有His6標(biāo)簽的Tsp03044原核表達(dá)載體。經(jīng)過(guò)表達(dá)條件的優(yōu)化，最終采用1 mM IPTG，18℃優(yōu)化過(guò)夜表達(dá)可溶性的Tsp03044蛋白。另外，采用1 mM IPTG，37℃進(jìn)行過(guò)夜誘導(dǎo)表達(dá)TspAd5和Tsp03548蛋白。并對(duì)其進(jìn)行可溶性蛋白的純化及脫鹽處理。
　　本研究首先通過(guò)熒光法測(cè)定10 mM Tris-HCl中酶-底物的反應(yīng)產(chǎn)物的熒光值，獲得各酶-底物反應(yīng)的初始速率，利用雙倒數(shù)法計(jì)算出酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km和kc

7、at值，進(jìn)而獲得各重組蛋白對(duì)三種酶的抑制常數(shù)Ki值。結(jié)果顯示，32 nm的Tsp03044對(duì)胰蛋白酶、α-糜蛋白酶、胃蛋白酶均有抑制作用，Ki值分別為10.05nM、12.53 nM和1.21 nM;32 nm的TspAd5對(duì)α-糜蛋白酶和胃蛋白酶有抑制作用，其Ki值分別為9.85 nM和5.92 nM;而32 nm的Tsp03548對(duì)胰蛋白酶沒(méi)有抑制作用，對(duì)α-糜蛋白酶的抑制作用非常弱(Ki=139.31 nM)，對(duì)胃蛋白酶具有較好的

8、抑制效果（Ki=3.83 nM）。另外，本研究還采用分光光度法檢測(cè)了Tsp03044、TspAd5、Tsp03548分別對(duì)凝血酶、彈性蛋白酶、組織蛋白酶G和顆粒酶B的抑制作用。
　　本研究檢測(cè)了不同溫度下Tsp03044和TspAd5兩種抑制劑對(duì)酶-底物反應(yīng)的影響。其結(jié)果以反應(yīng)的kcat值與溫度的關(guān)系表示，顯示了不同溫度下，重組蛋白對(duì)酶將底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的效率的影響。結(jié)果顯示，37℃是各反應(yīng)的最適溫度，對(duì)于胰蛋白酶來(lái)說(shuō)無(wú)論溫度高于或

9、低于37℃時(shí)酶將底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的能力均下降;而由于抑制劑的存在，抑制了胰蛋白酶的作用，各溫度下胰蛋白酶將底物轉(zhuǎn)化的能力均較低;對(duì)于α-糜蛋白酶而言，27～42℃下酶活力均較好，但它不能耐受47℃的高溫。Tsp03044在各溫度下對(duì)α-糜蛋白酶的抑制作用均較好，而42℃時(shí)的抑制作用突然降低可能是由于測(cè)量時(shí)出現(xiàn)誤差導(dǎo)致。
　　為了鑒定三種絲氨酸蛋白酶抑制劑的活性位點(diǎn)，本研究采用定點(diǎn)突變的方法制備了活性位點(diǎn)突變的重組蛋白，并檢測(cè)了各突變

10、蛋白對(duì)胰蛋白酶和α-糜蛋白酶的抑制效率，結(jié)果表明各突變蛋白對(duì)胰蛋白酶和α-糜蛋白酶的抑制效率均不如原蛋白，表明本研究所預(yù)測(cè)并突變的氨基酸即為該抑制劑的活性位點(diǎn)。
　　為了檢測(cè)Tsp03044、TspAd5、Tsp03548三種抑制劑在旋毛蟲(chóng)各生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)情況，本研究首先采用SYBR Green I熒光定量方法對(duì)三種基因的表達(dá)量進(jìn)行定量檢測(cè)，并以18SrRNA基因?yàn)閮?nèi)參基因，通過(guò)檢測(cè)熒光定量PCR反應(yīng)的Ct值，根據(jù)△△Ct法計(jì)算出

11、Tsp03044、TspAd5、Tsp03548基因相對(duì)于18S rRNA的表達(dá)量。結(jié)果顯示，三種抑制劑基因在旋毛蟲(chóng)的成蟲(chóng)及肌幼蟲(chóng)時(shí)期均有表達(dá)，但均在肌幼蟲(chóng)時(shí)期的表達(dá)量最大，說(shuō)明三種抑制劑在旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)時(shí)期發(fā)揮了更大的作用。而western blot方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了該結(jié)論。
　　旋毛蟲(chóng)Ascaris、Serpin、Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑Tsp03044、TspAd5、Tsp03548的成功表達(dá)純化為檢測(cè)三種蛋白的

12、功能奠定物質(zhì)基礎(chǔ);Tsp03044、TspAd5、Tsp03548對(duì)胰蛋白酶、α-糜蛋白酶、胃蛋白酶和其他蛋白酶的抑制活性研究、各重組蛋白活性位點(diǎn)的鑒定以及Tsp03044、TspAd5、Tsp03548在旋毛蟲(chóng)各生長(zhǎng)時(shí)期中表達(dá)量的檢測(cè)也為進(jìn)一步研究三種蛋白在保護(hù)旋毛蟲(chóng)免受宿主消化酶的消化作用等功能奠定了基礎(chǔ)?？傊狙芯拷Y(jié)果表明Tsp03044、TspAd5、Tsp03548為有效的絲氨酸蛋白酶抑制劑，本研究結(jié)果為研究Tsp03044