利用透膜熒光小分子探針對半胱氨酸組織蛋白酶蛋白活性表達譜的研究.pdf

1、在后基因組時代，最重要的工作就是要從整體水平上了解蛋白質(zhì)的表達和功能。在眾多的蛋白質(zhì)分析方法中，蛋白質(zhì)活性表達譜（activity-based protein profiling,ABPP）是研究酶的表達和功能的主要方法之一，這種方法的主要工具是一種基于酶活性的小分子探針（activity-based probe,ABP）。ABP探針是運用有機化學方法人工合成的靶向性小分子探針，利用它可以將蛋白質(zhì)組中一類特定的蛋白酶識別標記，隨后通過凝

2、膠電泳、質(zhì)譜鑒定等方法手段，對酶的表達和功能進行一系列分析。
　　細胞膜是阻止胞外物質(zhì)自由進入細胞的屏障，也為ABP探針在活細胞內(nèi)的應用帶來一定困難。突破細胞膜的限制，實現(xiàn)ABP探針在活細胞以及在體水平的應用，是蛋白質(zhì)活性表達譜研究的重要發(fā)展方向。本課題將細胞穿膜肽（cell-penetrating peptide,CPP）應用到ABP探針的設計中，合成了針對半胱氨酸組織蛋白酶的特異性探針：CpFABP和TCpABP。利用TCpA

3、BP探針標記活細胞中的半胱氨酸組織蛋白酶，對標記蛋白酶進行了基于質(zhì)譜技術的鑒定分析；將CpFABP探針作為一類新型的溶酶體標記物，對溶酶體依賴型細胞凋亡的起始階段進行了實時熒光成像分析。主要研究結果如下：
　?。?）用固相和液相結合的方式合成了針對半胱氨酸組織蛋白酶的一系列ABP探針，包括含有八聚精氨酸和環(huán)氧探頭的CpFABP、TCpABP透膜探針以及幾種用于對照實驗的探針。通過改進純化辦法，解決了透膜探針在純化的過程中容易發(fā)生環(huán)

4、氧開環(huán)的問題，獲得高純度的探針。
　?。?）TCpABP探針含有反應基團、熒光基團和Biotin基團，是一種具有透膜能力的三功能（trifunctional）探針。研究結果表明，盡管這種三功能探針含有不能夠透膜的熒光基團和Biotin基團，但是因為探針中含有八聚精氨酸穿膜肽，TCpABP探針能夠有效透膜進入細胞，實現(xiàn)了在活細胞中對活性狀態(tài)的半胱氨酸組織蛋白酶的標記。利用TCpABP探針中的Biotin基團，我們富集了被標記的活性半

5、胱氨酸組織蛋白酶，并且通過步驟優(yōu)化減少了非特異性結合的蛋白，降低了背景蛋白數(shù)量。在經(jīng)過質(zhì)譜鑒定之后，我們總共得到59個蛋白質(zhì)，包括7種半胱氨酸組織蛋白酶，其中兩種（Cathepsin F,Cathepsin O）在以前的ABPP分析中是沒有被檢測到的。我們通過基于圖譜計數(shù)的非標定量方法對已鑒定蛋白進行相對定量分析，發(fā)現(xiàn)半胱氨酸組織蛋白酶大多豐度值很高，而其余的52個蛋白的豐度較低。這些研究證明了TCpABP探針在活細胞對半胱氨酸組織蛋白

6、酶標記的高特異性，堿洗富集策略降低背景的有效性和“一步法”鑒定的高靈敏性。將鑒定的半胱氨酸組織蛋白酶的的相對活性值同mRNA的轉(zhuǎn)錄水平的數(shù)據(jù)進行比較分析，發(fā)現(xiàn)在7種組織蛋白酶中，六種的蛋白活性水平同mRNA轉(zhuǎn)錄水平相關性很好，相關系數(shù)達到0.84，但是Cathepsin H的蛋白活性水平同mRNA的水平差異很大，說明其mRNA水平同蛋白質(zhì)的表達是不成線性的。
　?。?）在正常的生理條件下，活性半胱氨酸組織蛋白酶定位在溶酶體中，我們

7、系統(tǒng)評估了CpFABP探針作為一種新型的溶酶體標記物標記溶酶體的特性。通過與商用的溶酶體標記物LysoTracker進行共定位分析，結果表明CpFABP探針能夠在各種不同類型的培養(yǎng)細胞中有效的標記溶酶體。此外，CpFABP探針在標記溶酶體后，可用于細胞固定，細胞膜透化作用以及氯化銨堿化處理等各種操作；而在相同的條件下，商用的LysoTracker失去了標記能力，顯示了CpFABP探針作為溶酶體標記物具有自己獨特的優(yōu)勢。在溶酶體依賴型凋亡