尼龍親和膜的制備及其在木瓜蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶抑制劑純化中的應(yīng)用研究.pdf

1、近年來，親和膜色譜技術(shù)在蛋白質(zhì)的分離純化中得到了快速發(fā)展，與柱親和色譜相比，親和色譜具有許多優(yōu)點(diǎn)，如流速高、分離速度快、壓降低和易于規(guī)模化生產(chǎn)等。 本文利用尼龍膜為基質(zhì)，通過甲醛活化，然后鍵合親水性的多聚物殼聚糖對(duì)其進(jìn)行改性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，尼龍膜的非特異性吸附大大降低，鍵合的殼聚糖含量為89.6 mg/g。 木瓜蛋白酶(EC3.4.22.2)主要存在于番木瓜的乳汁中，其應(yīng)用廣泛，包括細(xì)胞分離、皮革、化妝品、紡織、洗滌

2、劑、食品等行業(yè)，傳統(tǒng)的分離方法很難達(dá)到現(xiàn)代工業(yè)的純化要求和活性，并很難規(guī)模化生產(chǎn)。本論文首次以染料F3GA為配基制備了一種新型的分離木瓜蛋白酶的材料，研究了其物理性能和色譜性能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，染料F3GA的鍵合量為146.1μmol/g，染料親和膜對(duì)木瓜蛋白酶的吸附量達(dá)到235.3 mg/g。利用該親和膜從粗酶中提取木瓜蛋白酶，純化倍數(shù)為46.5倍。本文首次綜合運(yùn)用批量法和動(dòng)態(tài)法以配基染料F3GA與木瓜蛋白酶之間親和相互作用的熱力學(xué)和動(dòng)

3、力學(xué)進(jìn)行了深入研究，結(jié)果表明，親和膜對(duì)木瓜蛋白酶的吸附行為滿足Freundlich模型，動(dòng)力學(xué)分析適合Pseudo second—order kinetics模型，熱力學(xué)參數(shù)△G0，△H0，和△S0分別為—12.58 kJ/mol(298 K)，17.81 kJ/mol，和0.101 kJ/(mol K)，顯示木瓜蛋白酶在尼龍親和膜上的吸附行為是一個(gè)吸熱過程，負(fù)的自由能體現(xiàn)了木瓜蛋白酶傾向于從溶液中吸附到尼龍膜的表面，是一個(gè)自發(fā)的過程。

4、 另外，本論文將尼龍親和膜純化出的木瓜蛋白酶再次運(yùn)用于親和色譜，即以木瓜蛋白酶為配基，用于從土豆汁中分離純化半胱氨酸蛋白酶抑制劑。 半胱氨酸蛋白酶抑制劑是廣泛存在于動(dòng)植物組織和體液中的蛋白酶抑制劑，它能與木瓜蛋白酶、組織蛋白酶等半胱氨酸蛋白酶形成有力的、非共價(jià)結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)性抑制，抑制他們的活性，從而保護(hù)蛋白質(zhì)的二硫鍵不被破壞，阻止蛋白的降解。有研究表明，半胱氨酸蛋白酶抑制劑具有很好的生物防御作用，能參與各種生理和病理的

5、過程，如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎衰竭、骨質(zhì)疏松癥、腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移等。植物半胱氨酸蛋白酶抑制劑可抑制致病真菌，如赤霉菌、稻瘟病菌等的生長(zhǎng)。本論文首次以平板尼龍膜為基質(zhì)，將尼龍膜改性后鍵合上木瓜蛋白酶，對(duì)固載化的條件進(jìn)行了優(yōu)化，并對(duì)其固載化的尼龍膜的性質(zhì)進(jìn)行了研究，最后從土豆汁中純化出了高純度的半胱氨酸蛋白酶抑制劑。通過實(shí)驗(yàn)，可以看出經(jīng)過殼聚糖改性的尼龍膜可以作為一種優(yōu)良的親和膜載體，利用戊二醛作為交聯(lián)劑共價(jià)連接木瓜蛋白酶的方法也是可行的，并且得