發(fā)酵醋液中氨基甲酸乙酯免疫快速檢測技術研究.pdf

1、氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate,EC)，又稱烏拉坦，天然存在于面包、酸牛奶、乳酪、醬油及酒精類飲料等發(fā)酵食品中，是發(fā)酵過程中不可避免的伴隨產(chǎn)物，同時它也是一種多位點致癌物，可導致肺癌、淋巴癌、肝癌和皮膚癌等疾病。目前食品中的氨基甲酸乙酯被認為是繼黃曲霉毒素之后的又一個重要致癌物，因此研究EC快速簡便的檢測技術具有重要的現(xiàn)實意義。本文重點研究了氨基甲酸乙酯間接競爭 ELISA檢測技術和膠體金免疫層析技術。
　　采用戊二

2、醛法將EC分別與牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)進行偶聯(lián)，制備出人工抗原EC-BSA和包被抗原EC-OVA。將人工抗原EC-BSA與弗氏完全佐劑(或弗氏不完全佐劑)等量混合，乳化后采用背部皮下脊柱兩側(cè)多點注射法，免疫健康的新西蘭大耳白兔，獲得了含有多克隆抗體EC的免疫血清。制備的血清經(jīng)純化后用間接ELISA法測得血清效價為1:2000。建立了EC間接競爭ELISA檢測方法，實驗表明，在0.001 ng/ml-10000 ng/

3、ml范圍內(nèi)，IC50為7.39ng/ml，IC15為0.04 ng/ml。對氨基甲酸甲酯(MC)的交叉反應率為37.16％，說明制備的抗體具有其特異性。在不同發(fā)酵時間的發(fā)酵醋液中加入EC標準溶液，采用ELISA法測定,測得發(fā)酵時間為20天的發(fā)酵醋液中EC濃度為23 ng/ml,平均加標回收率為82.83%。同時用HPLC-FLD法進行比對，測得發(fā)酵時間為20天的發(fā)酵醋液中EC濃度為27 ug/L,平均加標回收率為85%，說明樣品前處理方

4、法可行。結果表明，本實驗建立的間接競爭ELISA法實現(xiàn)了EC的快速定量檢測。
　　研究了膠體金標記抗體的EC免疫快速檢測技術。采用檸檬酸三鈉還原法制備出直徑約為42 nm的膠體金溶液，將制備的膠體金溶液標記EC抗體，得到金標抗體。將EC-OVA點涂在NC膜上作為T帶，合理稀釋倍數(shù)的羊抗兔二抗點涂在NC膜上作為C帶，在T帶和C帶之間加入一定比例混合的EC標準溶液和純化后的金標抗體的混合液，讓包被原和EC標準溶液競爭金標抗體，以此制備