黑曲霉高轉(zhuǎn)苷活性α-葡萄糖苷酶的研究.pdf

1、功能性低聚糖(Functionaloligosaccharide,Oligo),是一類具有特定生理功能和生物活性的小分子寡糖,能選擇性促進人體內(nèi)的Bifidobacteria和Lactobacilli的增殖,維護腸道微生態(tài)平衡,促進宿主健康。我國啟動了OLIGO項目,倡導(dǎo)在公眾食品中添加Oligo以調(diào)節(jié)居民的膳食結(jié)構(gòu),改善公眾營養(yǎng)健康,減少社會公共衛(wèi)生支出。糖苷酶是酶法合成Oligo的關(guān)鍵酶,自然界廣泛分布,且不同來源的酶具有不同的特性

2、,適于不同的工業(yè)應(yīng)用。
　　 本實驗室選育的AspergillusnigerM-1菌株細胞產(chǎn)生一種具有高轉(zhuǎn)苷專一性的α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase),使細胞能更為有效地合成Oligo。在發(fā)酵木薯淀粉時,該菌株合成這種主要存在細胞內(nèi)的糖苷酶,其最優(yōu)的產(chǎn)酶條件包括33℃、初始pH6.5、孢子懸液接入量6％。在此條件下,細胞干重與α-glucosidase活力在40-72hrs間同步增加,在72hrs達到酶活力的高峰;底物

3、α-甲基葡萄糖苷在低濃度時誘導(dǎo)酶的產(chǎn)生,在8.0mmol/L以上時抑制酶的合成。經(jīng)過(NH4)2SO4沉淀、DEAE-cellulose52柱、DEAE-SepharoseCL-6B柱、SephadexG-100柱的分離,在SDS-PAGE電泳膠上得到單一的蛋白條帶,α-glucosidase活性組分被純化145倍,回收率19％,比活力為6385.47U/mg。純酶單一肽鏈,無亞基;經(jīng)SDS-PAGE電泳、HPLC分子排阻色譜、Seph

4、adexG-100柱分離估算的分子量范圍為110kDa-120kDa,為糖蛋白;等電點PI處于5.17-5.31范圍內(nèi),單一PI值;N-端含有N-Ser-Val-Pro-Gly-Thr-Glu-Tyr-Va-Val-序列;在0.02mol/L醋酸鈉緩沖液(Sodiumacetatebuffer,SAB,pH6.0)中,酶的最佳反應(yīng)溫度50℃,在60℃以下穩(wěn)定;最佳反應(yīng)pH6.0,在pH5.0-7.0之間比較穩(wěn)定;具有鍵位專一性,主要水解

5、底物的僅α-1,4-鍵;對α-甲基葡萄糖苷的Vmax=3.10×10-2mol/(L·min),Km=4.32mmol/L;純酶不能利用純麥芽糖,但能利用飴糖水溶液發(fā)生轉(zhuǎn)苷反應(yīng)。1mmol/L的Ca2+和Mg2+促進酶水解α-甲基葡萄糖苷的活力,而Fe2+、cu2+、Pb2+、Ag+明顯抑制酶的水解活力;p-CMB、MCA、EDC·HCl、ME、n-BSI、ACAC可以不同程度抑制酶活力,推測酶活性的維持與Cys、Asp或Glu、His

6、殘基,以及至少部分二硫鍵有關(guān)。
　　 在生長穩(wěn)定期初期收獲M-1的菌體,提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,經(jīng)過PCR擴增和表達克隆方法,從9個重組質(zhì)粒上獲得糖苷酶保守區(qū)段序列,經(jīng)3'-FullRACE、5'-FullRACE、數(shù)據(jù)庫檢索和PCR擴增,獲得的目標ORF序列全長3127bp,cDNA全長2958bp;BLAST結(jié)果顯示,所得cDNA序列與A.oryzae的agdA、A.flavusNRRL3357的agdA具有99％的

7、相似性,與A.nigerCBS513.88的agRlU、A.niger的aglA的相似性為72％。該cDNA被命名為agdM,并與表達載體pSE380連接,在Ecoli菌株中表達,其中,在BL21(DE3)中表達產(chǎn)物最多,約為細胞可溶性蛋白的14.2％;產(chǎn)物在SDS-PAGE電泳膠上為一分子量約120kDa的蛋白,不含有亞基;重組蛋白的粗酶液能水解α-甲基葡萄糖苷產(chǎn)生葡萄糖,活力最高達到19.62U/mL,在飴糖稀釋液中能夠生成與出發(fā)菌

8、A.nigerM-1不同的轉(zhuǎn)苷反應(yīng)產(chǎn)物。飛行質(zhì)譜顯示,重組蛋白的PI值為5.23,肽鏈特征與A.oryzae的agdA基因產(chǎn)物相似,屬于糖苷水解酶31家族(Glycosylhydrolasefamily,GH-31)。結(jié)果表明,A.nigerM-1的胞內(nèi)α-glucosidase是以前未被研究和發(fā)表的新酶蛋白。
　　 以中等聚合度的PVA-124為基礎(chǔ),制備多種水不溶性凝膠固定化A.nigerM-1細胞。其中,由10％PVA-1

9、0％細胞-微量gelatin的組合在經(jīng)過5次徹底冷凍和溫和地局部解凍的循環(huán)(-20℃冷凍24hrs后在室溫下解凍30min,再冷凍),可以使細胞的固定化得率接近100％,PVA膠體具有較高的強度,固定化效果好,所形成的穩(wěn)定大孔結(jié)構(gòu)膠體顆粒在使用過程中能較長時間維持多孔結(jié)構(gòu)。實驗中首次發(fā)現(xiàn)在生長穩(wěn)定期收集的A.niger新鮮細胞,表現(xiàn)出促進PVA膠體穩(wěn)定的特性,具有類似線狀填充物的作用。固定化后,細胞催化α-甲基葡萄糖苷水解的Km值從游離

10、狀態(tài)的20.50mmol/L下降為11.88mmol/L,Vmax值從1.71μmolglucose/(L·min)上升至2.84μmolglucose/(L·min),,說明凝膠的形成限制了底物和產(chǎn)物的擴散;膠體中的細胞具有更好的溫度穩(wěn)定性,反應(yīng)的最佳溫度上升到60℃;在pH=7.0-9.0和pH=3.0-5.0條件下酶活力保持更好。固定化細胞產(chǎn)生的有效異麥芽糖(Isomaltooligosaccharides,IMO)組分(異麥芽糖

11、、異麥芽三糖、潘糖)的總和為54.11％,略少于游離菌絲的57.3％水平,產(chǎn)生較少的葡萄糖、潘糖、異麥芽糖,在反應(yīng)的大部分時間里,體系含有的主要有效IMO組分是異麥芽糖。
　　 采用了本論文創(chuàng)新發(fā)展的8-MOP-UVA-LiCl方法對M-1菌株進行誘變選育。為首次將該方法應(yīng)用于工業(yè)Aspergillus菌株,該方法縮短UV照射時間約50％,大幅度減少在LiCl培養(yǎng)基上形成的菌落數(shù)量。在100個菌落中得到了4株產(chǎn)酶量比出發(fā)菌株升高

12、100％以上的菌株,其中,突變子CU-1產(chǎn)生接近2倍于出發(fā)菌株的糖苷酶,產(chǎn)酶能力遺傳穩(wěn)定,細胞對底物濃度的依賴程度下降,能在含15％麥芽糖的飴糖稀釋液中有效合成IMO,表現(xiàn)出更強的轉(zhuǎn)苷能力。
　　 開發(fā)了高濃度木薯淀粉發(fā)酵生產(chǎn)低聚異麥芽糖的工藝。在CU-1發(fā)酵實驗中,細胞逐步降解培養(yǎng)基中的木薯淀粉,生成大量含有α-1,6-糖苷鍵的分枝低聚糖,提供了IMO合成所需的有效糖苷供體和糖苷受體。在發(fā)酵的72hrs附近,發(fā)酵體系的pH下降

13、到約5.0,發(fā)酵液總糖消耗放緩,糖苷酶積累量達到較高水平;在72hrs-96hrs間,體系維持pH約5.0,適宜糖苷酶的積累,高濃度的糖苷供體和受體則促使酶持續(xù)將大部分糖類轉(zhuǎn)化成為IMO產(chǎn)物;在96hrs附近,糖苷酶活力達到峰值,非還原糖接近最大值88％,還原糖接近最低值約12％,總糖趨近最小值。這一工藝方法在不提高反應(yīng)溫度、不預(yù)制高濃度麥芽糖底物的條件下,實現(xiàn)了在水相體系中有效啟動和維持轉(zhuǎn)苷反應(yīng),延長高比例有效IMO產(chǎn)物的維持時間,工