黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因和花生白藜蘆醇合酶基因的真核表達(dá).pdf

1、B-葡萄糖苷酶(B—glucosidase，EC 3.2.1.21，簡(jiǎn)稱bgln)在纖維素的酶水解過程中為最后一步關(guān)鍵酶，不僅能夠水解白藜蘆醇苷為白藜蘆醇，還能夠作用于細(xì)胞壁碎片等其它細(xì)胞組成，從而生成更多的白藜蘆醇。 本研究以含有從黑曲霉中獲得的編碼bgln成熟肽的cDNA的克隆質(zhì)粒pMD19-bgln為模板，應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增出2600bp的bgln基因片段，利用真核表達(dá)載體pVT102U/a構(gòu)建pVT102U/a-bgln

2、重組質(zhì)粒，并通過電穿孔法將其轉(zhuǎn)化到釀酒酵母菌S78中，目標(biāo)是獲得能夠高效分泌B-葡糖苷酶的釀酒酵母，將其投入到生產(chǎn)中以提高葡萄酒的風(fēng)味和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，并進(jìn)一步探索利用基因工程技術(shù)改造微生物以有效利用纖維素的可行性方案，為人類社會(huì)的可持續(xù)發(fā)展做出貢獻(xiàn)。結(jié)果表明，外源基因在釀酒酵母菌中實(shí)現(xiàn)了分泌表達(dá)，但是外源蛋白的分子量約100kD較bgln理論值92kD偏大，且沒有檢測(cè)到酶活，這可能和外源蛋白未被正確糖基化有關(guān)。 白藜蘆醇是一種重要的

3、植物抗毒素，具有多種醫(yī)療保健作用。白藜蘆醇合酶(resveratrol synthase，簡(jiǎn)稱RS)是合成白藜蘆醇的關(guān)鍵酶。 在課題組成功構(gòu)建了含花生RS基因的重組畢赤酵母GS115基礎(chǔ)上，本研究篩選出能表達(dá)外源蛋白的畢赤酵母菌株。誘導(dǎo)表達(dá)后取重組酵母的發(fā)酵液經(jīng)SDS．PAGE檢測(cè)，結(jié)果顯示：重組酵母發(fā)酵液在45kD和100kD附近位置明顯增加了兩條表達(dá)量較高的蛋白帶，與RS的理論分子量接近，初步判斷可能是外源蛋白；對(duì)發(fā)酵條件做