創(chuàng)傷失血模型中miRNA對(duì)中性粒細(xì)胞的凋亡調(diào)控及對(duì)肝損傷的影響.pdf

1、目的:創(chuàng)傷失血是臨床常見(jiàn)的病理過(guò)程，機(jī)體受損后，損傷部位的細(xì)胞會(huì)大量釋放炎癥介質(zhì)，組織中性粒細(xì)胞(PMN)、內(nèi)皮細(xì)胞(EC)等細(xì)胞被快速激活，被激活的PMN及EC釋放氧自由基、毒性產(chǎn)物、蛋白酶及炎癥因子，并相互作用，炎癥反應(yīng)逐級(jí)放大，形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致PMN游離出血管外、血管通透性增大、滲出增多和組織水腫等一系列病理變化。重度創(chuàng)傷失血后，肝臟組織往往會(huì)表現(xiàn)出劇烈的反應(yīng)，該過(guò)程涉及巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等的歸巢，肝細(xì)胞炎性因子分

2、泌量升高，肝臟組織病變等一系列生理生化反應(yīng)。在MOF、SIRS模型中肝、肺、腸等器官常可見(jiàn)大量PMN浸潤(rùn)，抑制PMN過(guò)度激活及炎癥反應(yīng)強(qiáng)度為防治重度創(chuàng)傷后臟器損傷的可行思路之一。已有研究表明，miRNA參與了胚胎發(fā)育、造血過(guò)程、糖脂類代謝、細(xì)胞凋亡、癌癥發(fā)生等許多生物學(xué)過(guò)程中。因此，如何有效的闡明創(chuàng)傷失血的發(fā)病機(jī)制，減緩(甚至阻止)創(chuàng)傷失血的病程和后遺癥發(fā)生，成為迫切需要解決的議題。本研究通過(guò):一、以SD大鼠為研究對(duì)象，采用“骨折損傷合

3、并失血”的方法制備大鼠創(chuàng)傷失血模型，經(jīng)過(guò)免疫組織化學(xué)的方法考察傷后大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的肝組織病變情況，流式細(xì)胞術(shù)分析肝組織細(xì)胞中PMNs比例，采用IL-1β、TNF-α、趨化因子等為檢測(cè)指標(biāo)，考察了創(chuàng)傷失血大鼠炎性細(xì)胞因子的分泌;二、通過(guò)生物信息學(xué)方法篩選與大鼠肝臟中性粒細(xì)胞凋亡相關(guān)的候選miRNA，然后采用實(shí)時(shí)定量PCR方法驗(yàn)證候選miRNA;三、采用大鼠創(chuàng)傷失血16h后的PMNs為研究對(duì)象，考察候選miRNA對(duì)肝臟中性粒細(xì)胞細(xì)胞凋亡的影

4、響;四、提前給予大鼠miRNA靜脈注射，然后建立大鼠創(chuàng)傷失血模型，通過(guò)蛋白表達(dá)水平分析和組織病理切片分析，考察miRNA對(duì)創(chuàng)傷失血大鼠肝臟損傷的防護(hù)作用。
　　方法:第一部分，通過(guò)HE染色分析和血清ALT、AST檢測(cè)，比較建模不同時(shí)間點(diǎn)大鼠肝臟損傷情況;采用ELISA方法檢測(cè)肝組織勻漿液中炎性細(xì)胞因子的表達(dá)量，流式分析建模不同時(shí)間點(diǎn)肝臟中CD45+細(xì)胞數(shù)量;第二部分，通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)了大鼠PMNs凋亡相關(guān)的miRNAs，采用實(shí)時(shí)

5、定量PCR的方法對(duì)預(yù)測(cè)得到的miRNAs進(jìn)行進(jìn)一步篩選驗(yàn)證;第三部分，以大鼠傷后16h的PMNs為研究對(duì)象，采用Western Blot方法考察了目標(biāo)miRNA對(duì)中性粒細(xì)胞的L-選擇素，CD18，CD11b等分子表達(dá)的影響，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分析目標(biāo)miRNA干預(yù)后中性粒細(xì)胞凋亡率的變化;第四部分，經(jīng)免疫組織化學(xué)、ELISA、流式細(xì)胞術(shù)等方法考察miRNA對(duì)創(chuàng)傷失血大鼠肝臟損傷的保護(hù)作用。
　　結(jié)果:第一部分:建模16h時(shí)，血清ALT、

6、AST含量在傷后16h時(shí)達(dá)到峰值，結(jié)合肝組織HE染色結(jié)果提示傷后16h時(shí)肝臟的損傷情況最為嚴(yán)重，肝臟中多種炎性細(xì)胞因子的表達(dá)峰值出現(xiàn)在損傷4h到16h之間，流式細(xì)胞術(shù)提示損傷后16-24hCD45+細(xì)胞數(shù)量最高，反映了肝臟中激烈的免疫反應(yīng)。第二部分:通過(guò)大量的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和隨后實(shí)驗(yàn)研究，我們篩選到與中性粒細(xì)胞凋亡高度相關(guān)的miRNA:miR-126a-5p。第三部分:體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-126a-5p能抑制中性粒細(xì)胞中L-選擇素、

7、CD18、CD11b等分子的表達(dá)，并促進(jìn)受損大鼠的中性粒細(xì)胞的凋亡;第四部分:給予大鼠尾靜脈注射miR-126a-5p進(jìn)行干預(yù)，大鼠肝臟由創(chuàng)傷失血引起的病理變化，miRNA干預(yù)組明顯輕于模型對(duì)照組，比較兩組動(dòng)物肝臟炎性細(xì)胞因子及肝臟損傷標(biāo)志物轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)水平，miRNA對(duì)照組明顯低于模型對(duì)照組。
　　結(jié)論:成功建立了創(chuàng)傷失血肝損傷模型并確定了創(chuàng)傷失血后大鼠肝臟損傷最嚴(yán)重的時(shí)間節(jié)點(diǎn);首次篩選到了一個(gè)與大鼠骨折創(chuàng)傷失血后中性粒細(xì)胞凋亡