水牛顆粒細胞凋亡相關基因和miRNA表達及雌二醇對其表達調控的研究.pdf

1、哺乳動物卵泡在發(fā)育過程中,除少量發(fā)育成熟并排卵外,絕大部分發(fā)生退化、閉鎖。研究表明,卵泡閉鎖的主要誘因是顆粒細胞凋亡。目前已有人、鼠、牛、豬、綿羊和山羊等動物的顆粒細胞凋亡及其調控機理的研究報道,但對水牛卵泡顆粒細胞凋亡及卵泡閉鎖的分子機制研究較少。為此,本試驗首先對不同閉鎖程度水牛卵泡顆粒細胞凋亡相關基因及miRNA的表達規(guī)律進行了分析,以了解顆粒細胞凋亡與卵泡閉鎖的關系,初步闡明水牛卵泡閉鎖的分子機制。其次,通過研究雌二醇(E2)對

2、體外培養(yǎng)的水牛顆粒細胞凋亡、細胞周期、凋亡相關基因和miRNA表達的影響,探索E2在調控水牛顆粒細胞凋亡過程中的作用,為優(yōu)化顆粒細胞體外培養(yǎng)條件以及進一步了解水牛卵泡閉鎖機理奠定基礎。
　　一、不同閉鎖程度水牛卵泡顆粒細胞凋亡相關基因和miRNA的表達。
　　1.采用HE染色、DNA ladder分析和Tunel法檢測了HF、EF和PF三種不同閉鎖程度水牛卵泡顆粒細胞的凋亡狀態(tài)。結果發(fā)現,HF卵泡腔中無脫落的顆粒細胞,其中的

3、顆粒細胞基因組 DNA沒有出現明顯的DNA ladder,細胞凋亡率為9.32％。EF卵泡內壁結構較松散,卵泡腔中可見到有少量脫落的顆粒細胞,其顆粒細胞基因組DNA出現明顯的DNA ladder,細胞凋亡率為17.24%。PF顆粒細胞大部分脫落于卵泡腔中,卵泡內壁退化嚴重,基因組DNA降解嚴重,出現明顯的DNA ladder,凋亡率達20.26%。
　　2.利用qRT-PCR方法分析了不同閉鎖程度水牛卵泡顆粒細胞凋亡相關基因和mi

4、RNA的表達。結果顯示,死亡受體通路相關的Fas等基因在HF、EF、PF三種顆粒細胞中均有表達,且隨著卵泡閉鎖程度加深,其表達量顯著升高(P<0.05)。TNFα基因在HF顆粒細胞中不表達而在EF和PF中表達,TRAIL基因在三種顆粒細胞中均不表達。所檢測的線粒體通路相關基因在三種顆粒細胞中均有表達,其中Bcl-2、Bcl-xl和MCL-1基因在HF顆粒細胞表達最高,隨著卵泡閉鎖程度加深,其表達量逐漸降低;Bax等基因在PF顆粒細胞表達

5、最高,且隨著卵泡閉鎖程度加深其表達量逐漸升高。內質網應激通路相關基因在三種顆粒細胞均有表達,且隨著卵泡閉鎖程度加深其表達量逐漸升高。所檢測的包括 miR21-5P在內的16條 miRNA在HF、EF和PF顆粒細胞均有表達,其中miR21-5P等10條miRNA的表達水平隨著卵泡閉鎖程度加深呈先升高后下降的趨勢;miR99a-5P等6條miRNA的表達量隨著卵泡閉鎖程度加深而逐漸降低。
　　3.運用免疫組化方法分析了細胞凋亡相關蛋白

6、 Fas和Caspase3在不同閉鎖程度水牛卵泡顆粒細胞中的表達。結果顯示,Fas和Caspase3蛋白在HF、EF、PF顆粒細胞中均有表達,且隨著卵泡閉鎖程度加深其表達水平逐漸增強。
　　二、E2對體外培養(yǎng)水牛顆粒細胞凋亡的影響及其調控機制。
　　1.采用Tunel法分析了E2對體外培養(yǎng)水牛顆粒細胞凋亡的影響。結果發(fā)現,濃度為10-5 mol/L的E2能夠有效抑制顆粒細胞凋亡,且呈現出劑量依賴性;而雌激素受體抑制劑ICI1

7、82780能夠阻斷這一效應。
　　2.采用流式細胞儀分析了E2對水牛顆粒細胞細胞周期的影響。結果顯示,單獨添加10-5 mol/L E2處理顆粒細胞后,G0/G1期細胞比例減少,S期細胞比例顯著增加,ICI182780單獨處理和E2+ICI182780聯(lián)合處理的樣品細胞周期均沒有顯著變化。
　　3.利用 qRT-PCR技術分析了 E2對水牛顆粒細胞凋亡相關基因和miRNA表達的影響。結果顯示,ERβ和Fas等凋亡相關基因及m

8、iRNA在不同處理組中均有表達,E2處理后,ERβ和Bcl-2基因表達水平提高,Fas等基因和miR21-5p等 miRNA表達降低,其他處理組相關基因和miRNA表達無顯著變化。
　　4.采用western-blot方法檢測了E2對水牛顆粒細胞凋亡相關蛋白表達的影響。結果顯示,E2處理后Fas、Bax、caspase9蛋白表達量降低,其蛋白質水平分析結果與mRNA水平表達情況一致。其他處理組3個蛋白的表達均無顯著變化。