NF-κB抑制劑對急性肺損傷大鼠趨化因子基因表達(dá)和中性粒細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、目的：急性肺損傷(Acutelunginjury，ALI)是由多種損傷原因造成的肺損害。研究資料表明，在ALI形成的病理過程中中性粒細(xì)胞(polymorphonuclearneutrophil，PMN)發(fā)揮著重要作用。大量研究顯示，當(dāng)機(jī)體遭受如創(chuàng)傷、感染等嚴(yán)重外界打擊時，PMN會迅速進(jìn)入肺實質(zhì)大量聚集、扣押并持續(xù)活化，這在其后發(fā)生的急性肺損傷中發(fā)揮著重要作用。目前，有關(guān)ALI時PMN為何會大量向肺組織遷移、聚集以及進(jìn)入肺組織內(nèi)的PMN如

2、何演變，這些變化又對急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展有何影響等問題的研究還尚少。本實驗主要通過腹腔注射脂多糖(lipopolysacchride，LPS)復(fù)制大鼠ALI模型，研究ALI時大鼠肺內(nèi)中性粒細(xì)胞趨化因子(cytokine-inducedneutrophilchemoattractant，CINC)基因的表達(dá)和PMN凋亡率的變化，探討兩者對PMN的影響及它們在ALI發(fā)病中的作用機(jī)制，后進(jìn)一步從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB角度研究其對CINC表達(dá)

3、和PMN凋亡的調(diào)節(jié)機(jī)制，并給予抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(Ammoniumpyrrolidinedithiocarbamate，PDTC)進(jìn)行干預(yù)，從而為臨床治療ALI提供理論依據(jù)，也為開拓新的ALI治療思路提供參考。 方法：1動物模型的建立及分組：健康雌性Wistar大鼠120只，體重230-250克，購自河北省實驗動物中心。采用腹腔注射脂多糖(LPS)方法復(fù)制動物急性肺損傷模型。動物分組：120只大鼠隨機(jī)分為4組：①正常對

4、照組(C組=12只)：腹腔注射生理鹽水3ml/Kg；②PDTC對照組(P組=12只)：先腹腔注射PDTC120mg/Kg，半小時后再腹腔注射生理鹽水3ml/Kg；③急性肺損傷組(L組=48只)：大鼠腹腔注射LPS3mg/Kg；④急性肺損傷+PDTC干預(yù)組(P+L組=48只)：先腹腔注射PDTC120mg/Kg進(jìn)行干預(yù)，半小時后再腹腔注射LPS3mg/Kg。后兩組又分別以腹腔注射LPS后的2h、4h、8h和12h作觀測點，處死動物、取材，

5、每個觀測時間點組12只大鼠。 2標(biāo)本的制備：因所測全部指標(biāo)無法一次留取成功，故先隨機(jī)從4個實驗組中各取6只大鼠行第一部分取材：制模后，于各不同觀測時間點腹腔注射10％水合氯醛3.5ml/Kg麻醉，固定動物、開胸、心臟放血處死大鼠后，速取左肺葉置液氮中速凍，-80℃冰箱保存，待測。另取右肺上、下兩葉，上葉稱濕重，放入烤箱；下葉置4％多聚甲醛固定，待測。再取各實驗組剩余的6只大鼠行第二次取材：同法制模、麻醉、處死動物，氣管插管，結(jié)扎

6、右肺支氣管，取右肺下葉置4％多聚甲醛內(nèi)固定，待做病理切片；行左肺支氣管肺泡灌洗，收集全部灌洗液(bronchoalveolarlavagefluid，BALF)分離PMN。3指標(biāo)的測定：光鏡觀察肺組織病理變化判定制模成功后，稱重檢測肺組織濕/干重比值(W/D)、RT-PCR法檢測肺組織CINCmRNA表達(dá)、免疫組化法檢測NF-κBp65蛋白表達(dá)、流式細(xì)胞儀檢測BALF中PMN凋亡率。 4統(tǒng)計學(xué)分析：所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((-

7、x)±s)表示，采用SAS6.12統(tǒng)計軟件分析。采用方差分析、Q檢驗和直線相關(guān)進(jìn)行分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果：1肺組織病理結(jié)果：C組、P組，肺組織結(jié)構(gòu)完整，無炎癥細(xì)胞滲出；L組，肺間隔增厚，肺泡壁斷裂，大量PMN等炎癥細(xì)胞浸潤，且隨時間的延長炎性細(xì)胞浸潤增多，肺組織損傷程度加重。P+L組，肺組織有同L組相似的病理表現(xiàn)，但對應(yīng)相應(yīng)時間點，肺組織損傷程度較輕。 2肺組織濕/干重(W/D)比值：C組[4.28

8、±0.055]與P組[4.32±0.055]比兩者差異無意義(P＞0.05)；L組，各時間點W/D比值[2h組4.71±0.081、4h組4.94±0.082、8h組5.45±0.084、12h組5.80±0.085]均較對照組C組高，且隨注射LPS后時間的延長W/D比值不斷增高，L12h組比值達(dá)高峰(P＜0.05)；P+L干預(yù)組，各時間點W/D比值[2h組4.43±0.058、4h組4.52±0.057、8h組4.96±0.058、1

9、2h組5.31±0.058]均較相應(yīng)時間點L各組數(shù)值減低(P＜0.05)，但與對照組P組比，各組數(shù)值仍較高(P＜0.05)。 3肺組織CINCmRNA表達(dá)：C組[0.02±0.016]與P組[0.03±0.013]比兩者差異無意義(P＞0.05)；L組，各時間點CINCmRNA[2h組0.65±0.056、4h組0.34±0.029、8h組0.19±0.024、12h組0.10±0.014]均較對照組C組高(P＜0.05)，其中

10、L2h組CINCmRNA達(dá)高峰(P＜0.05)，之后表達(dá)逐漸減低；P+L干預(yù)組，各時間點CINCmRNA[2h組0.46±0.040、4h組0.27±0.041、8h組0.15±0.030、12h組0.06±0.025]與相應(yīng)時間點L各組比，表達(dá)下降(P＜0.05)，但與對照組P組比，CINCmRNA仍高(P＜0.05)。 4肺組織NF-κBp65表達(dá)：光鏡下肺組織細(xì)胞內(nèi)有棕黃色顆粒的為NF-κBp65呈陽性表達(dá)的細(xì)胞。記數(shù)陽性

11、細(xì)胞數(shù)，C組[(166.17±13.83)個]與P組[(163.83±5.56)個]比兩者差異無意義(P＞0.05)；L組，各時間點陽性細(xì)胞數(shù)[2h組(608.17±27.04)個、4h組(376.50±14.10)個、8h組(231.33±18.61)個、12h組(210.67±12.29)個]均較對照組C組多(P＜0.05)，其中L2h組陽性細(xì)胞最多(P＜0.05)，且光鏡示棕黃色顆粒大多表達(dá)在細(xì)胞核內(nèi)，此時NF-κB呈活化狀態(tài)，之

12、后陽性表達(dá)逐漸減少；P+L干預(yù)組，各時間點陽性細(xì)胞數(shù)[2h組(366.50±15.23)個、4h組(268.83±25.02)個、8h組(196.50±12.69)個、12h組(186.83±8.35)個]與相應(yīng)時間點L各組比較，陽性細(xì)胞減少(P＜0.05)，但與對照組P組比，表達(dá)仍較多(P＜0.05)。 5BALF中PMN凋亡率：用流式細(xì)胞儀測定BALF中PMN的凋亡率，C組[(13.12±1.73)％]與P組[(13.35±

13、1.62)％]比兩者差異無意義(P＞0.05)；L組，各時間點PMN的凋亡率[2h組(6.98±0.71)％、4h組(3.52±0.34)％、8h組(4.51±0.31)％、12h組(5.02±0.11)％]均較對照組C組低(P＜0.05)，其中L4h組PMN的凋亡率最低，此時細(xì)胞壽命最長(P＜0.05)，之后凋亡率逐漸增加；P+L干預(yù)組，各時間點PMN的凋亡率[2h組(8.70±0.43)％、4h組(5.74±0.17)％、8h組(6

14、.92±0.07)％、12h組(7.49±0.12)％]與相應(yīng)時間點L各組比凋亡率均增加(P＜0.05)，但與對照組P組比，PMN的凋亡率仍較低(P＜0.05)。 6相關(guān)分析：NF-κBp65與CINCmRNA和PMN凋亡率之間均具有相關(guān)性，前兩者呈顯著正相關(guān)r=0.9643，P＜0.001；后兩者呈負(fù)相關(guān)r=-0.3022，P＜0.05。另外，CINCmRNA與PMN凋亡率兩者之間也有相關(guān)關(guān)系，呈負(fù)相關(guān)r=-0.3286，P＜

15、0.05。 結(jié)論：1大鼠急性肺損傷時存在肺組織CINCmRNA高表達(dá)、PMN向肺組織大量浸潤和BALF中PMN凋亡延遲的現(xiàn)象，表明ALI的發(fā)生可能與CINC誘導(dǎo)、趨化PMN由外周血向肺組織內(nèi)遷移以及進(jìn)入肺內(nèi)的PMN發(fā)生凋亡延遲、壽命延長、持續(xù)發(fā)揮炎性反應(yīng)等變化有關(guān)。 2CINCmRNA和PMN凋亡受多種因子影響。急性肺損傷時大鼠肺組織NF-κB激活，NF-κBp65表達(dá)增多，其增高與肺組織CINCmRNA高表達(dá)和BALF

16、中PMN凋亡延遲都具有相關(guān)關(guān)系，表明CINCmRNA和PMN的凋亡受轉(zhuǎn)錄因子NF-κB調(diào)節(jié)。另外，CINCmRNA和PMN凋亡之間也有相關(guān)性，CINCmRNA的高表達(dá)可抑制PMN凋亡的比例，表明急性肺損傷是由多種炎癥介質(zhì)共同參加、相互影響的級連式反應(yīng)過程。 3PDTC作為NF-kappaB的抑制劑可通過抑制NF-κB的活化、入核，從起始階段就降低了CINCmRNA的高表達(dá)并使PMN保持正常的凋亡比例，減少了引起肺組織損傷的PMN