α2A腎上腺素能受體在膿毒癥誘導(dǎo)的大鼠心臟血管內(nèi)皮細胞活化中的作用.pdf

1、目的：先前的研究表明，a2A腎上腺素能受體（a2A-AR）阻斷劑BRL44408可提高膿毒癥大鼠的生存率、改善膿毒癥大鼠的心功能并降低心臟腫瘤壞死因子-a（TNF-a）、細胞間黏附分子-1（ICAM-1）與血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）的表達，但其作用靶點尚不明確。業(yè)已證明，血管內(nèi)皮細胞上存在a2A-AR。顯然，BRL44408降低心臟 TNF-a與黏附分子的表達可能與其作用于心臟血管內(nèi)皮細胞從而抑制膿毒癥誘導(dǎo)的心臟內(nèi)皮細胞活化相

2、關(guān)。因此，本研究分別觀察了a2-AR激動劑和/或a2A-AR阻斷劑對膿毒癥大鼠心臟、內(nèi)毒素（LPS）灌流的離體心臟及培養(yǎng)的心臟微血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生 TNF-a、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）和黏附分子的影響，進一步探討a2A-AR在膿毒癥心臟血管內(nèi)皮細胞活化中的作用與相關(guān)機制。
　　方法:
　　1.通過盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（CLP）復(fù)制膿毒癥大鼠模型，用Western blot觀察CLP對大鼠心臟組織中a2A-AR的表達量有無影響，

3、并進一步通過免疫熒光染色技術(shù)對a2A-AR進行定位。
　　2.用Western blot分析和免疫熒光染色方法觀察a2A-AR阻斷劑BRL44408對膿毒癥大鼠心臟組織及心臟血管內(nèi)皮TNF-a、ICAM-1、VCAM-1和iNOS表達的影響。
　　3.通過免疫熒光染色技術(shù)觀察a2-AR的激動劑鹽酸右美托咪啶（DEX）對膿毒癥大鼠心臟血管內(nèi)皮TNF-a、ICAM-1、VCAM-1和iNOS表達的影響，并觀察兩種不同劑量的DEX

4、對膿毒癥大鼠生存率的影響。
　　4.采用Langendorff離體心臟灌流技術(shù)，觀察LPS和/或a2-AR激動劑B-HT933對離體大鼠心功能的影響；用ELISA法檢測灌流液中TNF-a的濃度；熒光定量PCR法檢測心臟組織中TNF-a、ICAM-1和VCAM-1 mRNA的表達；免疫熒光染色技術(shù)觀察離體心臟灌流2h后心臟內(nèi)皮細胞上上述炎癥介質(zhì)的表達。
　　5.培養(yǎng)心臟微血管內(nèi)皮細胞，通過免疫熒光染色技術(shù)進行鑒定、并觀察a2A

5、-AR在心臟微血管內(nèi)皮細胞上的表達；用1μg/mL的LPS刺激內(nèi)皮細胞，通過熒光定量PCR法觀察a2-AR激動劑B-HT933和/或?2A-AR阻斷劑BRL44408對LPS刺激后2 h內(nèi)皮細胞中TNF-a、ICAM-1和VCAM-1 mRNA表達的影響；通過Western blot分析觀察a2-AR激動劑和/或a2A-AR阻斷劑對LPS刺激0.5 h后心臟微血管內(nèi)皮細胞中IkBa、p38 MAPK、JNK和ERK磷酸化的影響。

6、　　結(jié)果:
　　1. CLP誘導(dǎo)6 h對大鼠心臟組織a2A-AR的表達量無明顯影響；心臟組織冰凍切片免疫熒光染色顯示，心臟血管內(nèi)皮細胞上存在a2A-AR。而肺組織冰凍切片免疫熒光染色顯示，肺血管內(nèi)皮上未見?2A-AR的表達。
　　2. a2A-AR阻斷劑BRL44408可降低CLP術(shù)后6 h大鼠心臟組織中TNF-a、ICAM-1、VCAM-1和iNOS的表達；免疫熒光染色結(jié)果顯示，與CLP組相比，a2A-AR阻斷劑BRL44

7、408處理的膿毒癥大鼠心臟血管內(nèi)皮細胞上上述炎癥細胞因子的表達也相應(yīng)減少，而BRL44408處理并不影響膿毒癥大鼠肺血管內(nèi)皮上ICAM-1和VCAM-1的表達。
　　3.a2-AR的激動劑DEX處理的CLP組，CLP術(shù)后6 h心臟血管上TNF-a、ICAM-1、VCAM-1和iNOS的表達明顯強于CLP組；40μg/kg的DEX對膿毒癥大鼠死亡率無顯著影響，但腹腔注射80μg/kg的DEX可顯著增加膿毒癥大鼠的死亡率。
　　

8、4. a2-AR的激動劑B-HT933可加重LPS灌流誘導(dǎo)的大鼠離體心臟心功能障礙；在灌流早期，B-HT933與LPS共同灌流組，灌流液中TNF-a的濃度顯著高于LPS單獨灌流組；LPS灌流后大鼠心臟組織中TNF-a、ICAM-1和VCAM-1 mRNA的表達顯著高于對照組，而B-HT933顯著增加了LPS誘導(dǎo)的TNF-a、ICAM-1和VCAM-1 mRNA的表達；LPS灌流2 h后，心臟免疫熒光染色結(jié)果顯示，LPS可增加心臟血管內(nèi)皮

9、細胞TNF-a、ICAM-1和VCAM-1的表達，而B-HT933可加強LPS的這一反應(yīng)。
　　5.通過免疫熒光技術(shù)對培養(yǎng)的原代細胞進行鑒定，證實其為心臟微血管內(nèi)皮細胞，并且觀察到內(nèi)皮細胞上有a2A-AR的表達；LPS刺激心臟微血管內(nèi)皮細胞后，細胞中TNF-a、ICAM-1和VCAM-1 mRNA表達量顯著升高，B-HT933處理心臟微血管內(nèi)皮細胞顯著加強LPS誘導(dǎo)的TNF-a和ICAM-1mRNA的表達，而a2A-AR的阻斷劑B

10、RL44408預(yù)處理可消除B-HT933的增強效應(yīng)；LPS處理增強了心臟微血管內(nèi)皮細胞IkBa和p38 MAPK的磷酸化，B-HT933預(yù)處理通過a2A-AR依賴的方式促進LPS誘導(dǎo)的IkBa和p38 MAPK的磷酸化。
　　結(jié)論:
　　1.大鼠心臟血管內(nèi)皮細胞上存在a2A-AR。
　　2.阻斷a2A-AR可降低膿毒癥大鼠心臟血管內(nèi)皮細胞TNF-a、ICAM-1、VCAM-1和iNOS的表達，抑制膿毒癥誘導(dǎo)的心臟血管內(nèi)